A CLIVAGEM COM ENZIMA DE RESTRIÇÃO

RELATÓRIO DE AULA PRÁTICA - BIOLOGIA MOLECULAR -

Nomes: Francieli Rocha, Luana Salla, Thaiane Gomes e Wagner Gonçalves.

Grupo B02                         Data da aula: 04/10/12        Data de entrega: 11/10/12

Aula: CLIVAGEM COM ENZIMA DE RESTRIÇÃO

OBJETIVO DA AULA

Realizar a clivagem de um produto de PCR com enzima de restrição.

RESULTADOS OBTIDOS

Através da enzima de restrição TaqI que reconhece a sequência 5'TCGA e 3'AGCT o DNA foi cortado da seguinte forma         T 5-P         3-OH CGA

                                                        CGA 3-OH        5-P T.

QUESTÕES

1. As enzimas de restrição são chamadas popularmente de ‘tesourinhas biológicas’. Explique a função experimental dessas enzimas.

Essas enzimas “picotam” a molécula de DNA sempre em determinados pontos específicos, chamados sítios de restrição. A clivagem leva a produção de fragmentos contendo pontas 5’ –P e 31 –OH livres. Esses “cortes” catalisam a destruição de uma ligação fosfodiéster entre dois nucleotídeos consecutivos ligados a determinadas bases. São importantes para detecção de polimorfismo, através da detecção de variações na seqüência de DNA; clivagem do DNA total, para produzir fragmentos de tamanho conhecido; gerar fragmentos para posterior clonagem molecular.

1. Qual a importância do tampão e da temperatura adequados para o bom funcionamento de cada enzima?

A importância do tampão e da temperatura adequada é para fornecer um ambiente favorável para cada tipo de enzima. As enzimas de restrição necessitam do cofator Mg+ e temperaturas especificas (65ºC).

1. Represente a sequencia de DNA das duas fitas após a clivagem com a enzima DdeI que reconheça o sitio descrito no exemplo abaixo.

5’-TGCTTAC^TAGCTACCA-3’

DdeI

3’- GAT^C -5’

GAT 3-OH                5-P C

5’- C^TAG -3’

C 5-P                        3-OH TAG