A Cinética Enzimática

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Coordenadoria de Biotecnologia

Curso de Bioquímica

Dosagem de glicose: método DNS

&

Açúcares Redutores

Professores: Fabrícia e Daniela
Turma:

PQ341

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                         Alunos:

             Alissandra Gaudêncio

                 Caroline S. Leal

             Pedro Miguel Russano

               Frederico Guimarães

Data da realização da prática: 15 de Junho de 2016

Sumário

Sumário        

1.0        Introdução        

2.0        Objetivo        

3.0        Materiais e Métodos        

Materiais e reagentes        

Métodos        

4.0        Resultados        

4.2 Curso Temporal        

4.3 Influência do pH        

4.4 Influência da temperatura        

4.5 Influência da Concentração do Substrato e do Inibidor        

4.6 Gráfico dos duplos recíprocos        

5.0     Discussão..................................................................................................

6.0        Referência bibliográfica        

1. Introdução

 

1. Objetivo

        

1. Materiais e Métodos

Materiais e reagentes

Solução padrão de p-nitrofenol (PNP) 0,1 mM em tampão Tris-HCl pH 9,5

Solução de p-nitro-fenil-fosfato (PNPP) 1 mM em tampão Tris-HCl pH 9,5

Solução de p-nitro-fenil-fosfato (PNPP) 1 mM em tampão água tipo III

Solução tampão Tris-HCl 0,2 M, pH 7,5, 8,5 e 9,5

Solução de Na2HPO4   0,4 mM em tampão Tris-HCl 0,2 M, pH 9,5 (sol. tampãoTris-Pi-HCl)

Soluções tampão borato-NaOH 0,3 M, pH 9,5, 10,5 e 11,5

Soluções tampão citrato HCl 0,2 M, pH 5,5, 6,5 e 7,5

Solução de NaOH 2 M

Solução de enzima: fosfatase alcalina 0,2μg/mL em Tris-HCl pH 9,5

Pipetador automático 20 - 200 μL  

Pipetador automático 20 – 100 μL

Pipetador automático 200 – 1000 μL

Tubos de ensaio

Vortex

Banho de gelo (0 oC)

Banho-maria (37 oC)

Banho-maria (68 oC)

Banho-maria (25°C)

Placa de 96 poços para leitor de elisa

Leitor de elisa

Métodos

1. Curso Temporal

Transferiu-se, com o auxílio de um pipetador automático, as seguintes alíquotas para um Erlenmeyer previamente identificado.

- 1250μL de tampão Tris-HCl 0,2M pH 9,5

- 625 μL de PNPP 1mM

         Em seguida, incubou-se a solução resultante em um banho-maria a 37oC por 5 minutos. Após transcorrido o tempo estipulado, a solução foi transferida para 9 tubos de ensaio, contendo em casa tubo 200μL. Pipetou-se 6,25μL de NaOH em cada tubo. Adicionou-se 125μL de enzima fosfatase alcalina 0,2μg/mL em Tris-HCl pH 9,5. Retirou-se uma alíquota de 200μL da solução que foi colocada no tubo marcado como B (branco) e novamente incubou-se o Erlenmeyer no banho-maria a 37 oC.

Iniciou-se a contagem do tempo e retiraram-se alíquotas de 200μL da solução para que fossem colocadas nos poços da placa de elisa, nos tempos estipulados na tabela a seguir.

TUBO	NaOH 2M (μL)	Tempo de Incubação (min)	Alíquota do meio de reação (μL)
B	6,25μL	0	200μL
1	6,25μL	3	200μL
2	6,25μL	6	200μL
3	6,25μL	9	200μL
4	6,25μL	12	200μL
5	6,25μL	15	200μL
6	6,25μL	20	200μL
7	6,25μL	30	200μL
8	6,25μL	45	200μL

Tabela 1

Após a coleta do último ponto de 45 minutos, foi feita a leitura de absorbância, a 405 nm, no leitor de elisa, utilizando-se o primeiro poço como branco, para calibração do aparelho.