Microbiologia

Introdução

O grupo dos coliformes totais é composto por bactérias da família Enterobacteriaceae, capazes de fermentar a lactose com produção de gás, quando incubados a 35-37°C, por 48 horas. São bacilos gram-negativos e não formadores de esporo (FRANCO e LANDGRAF, 1996).

Fazem parte desse grupo predominantemente bactérias pertencentes aos gêneros Escherichia, Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella. Destes, apenas a Escherichia coli tem como hábitat primário o trato intestinal do homem e animais. Os demais (Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella), além de serem encontrados nas fezes, também estão presentes em outros ambientes como vegetais e solo, onde persistem por tempo superior ao de bactérias patogênicas de origem intestinal como Salmonella e Shigella. Consequentemente, a presença de coliformes totais no alimento não indica, necessariamente, contaminação fecal recente ou ocorrência de enteropatógenos (FRANCO e LANDGRAF, 1996).

As bactérias pertencentes ao grupo dos coliformes termotolerantes correspondem aos coliformes totais que apresentam a capacidade de continuar fermentando lactose com produção de gás, quando incubadas a temperatura de 44-45°C (FRANCO e LANDGRAF, 1996).

A técnica do número mais provável, também chamada técnica dos tubos múltiplos, é outra maneira bastante utilizada pelos laboratórios de microbiologia de alimentos para estimar a contagem de alguns tipos de micro-organismos, como coliformes totais, termotolerantes, E. coli e Staphylococcus aureus (FRANCO e LANDGRAF, 1996).

Por esta técnica pode-se obter informações sobre a população presuntiva de coliformes (teste presuntivo), sobre a população real de coliformes (teste confirmativo) e sobre a população de coliformes de origem fecal (coliformes fecais) (SIQUEIRA, 1995).

Objetivo

Fornecer noções básicas sobre procedimentos de análise de coliformes totais, termotolerantes em alimentos.

Materiais

Amostra de alimento: Leite cru.

Meios e soluções:

- Erlenmeyer 250 ml

- Tubos de diluição: tubos com 9,0mL de água peptonada 0,1 % / tubo;

- Teste presuntivo: 9 tubos com 10 mL de caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) com tubos de Durhan no seu interior;

- Teste confirmativo para coliformes totais: 9 tubos com 10 mL de caldo Verde Bile Brilhante (VB) com tubos de Durhan no seu interior;

- Teste confirmativo para coliformes termotolerantes: 9 tubos com 10 mL de caldo E. coli (EC) com tubos de Durhan no seu interior;

Utensílios e equipamentos: Pipetas com capacidade de 1,0 ou 2,0 mL; espátulas estéreis para pesagem da unidade analítica; estufa incubadora regulada à 35 + 0,5ºC; banho-maria regulado a 45,5 + 0,2 º C.

Procedimento: Desinfetou-se a superfície de trabalho com solução de etanol 70%. Antes da abertura da embalagem, limpou-se a área em volta da garrafa onde foi retirada a amostra, usando solução de etanol 70%. Pipetou-se 25 ml da amostra de leite cru transferindo para um erlenmeyer contendo 225 ml de água peptonada 0,1% homogeneizando 25 vezes. A partir da 1ª diluição, procedeu-se as diluições seriadas 10-², e 10-³ transferindo respectivamente de cada diluição  1,0 mL para tubos contendo 9,0 mL de água peptonada 0,1%, homogeneizando 25 vezes. Para o teste presuntivo, adicionou-se 1 mL das diluições 10-1 , 10-2 e 10-3 da amostra em três séries de tubos contendo 10mL do meio Caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) com tubos de Durhan. Incubou-se os tubos a 35ºC por 24 horas e observou-se se houve crescimento com produção de gás nos tubos. Após as 24 horas verificou-se que todos os tubos estavam positivos, então procedeu-se a enumeração de coliformes totais.  A partir de cada tubo positivo da etapa anterior, transferiu-se uma alçada de inóculo da cultura para tubos com Caldo Verde Bile Brilhante (VB) contendo tubos de Durhan. Incubou-se os tubos a 35 ºC por 24 horas e observou-se se houve crescimento com produção de gás. Após a confirmação de crescimento, procedeu-se a enumeração de coliforme termotolerantes. A partir de cada tubo positivo do teste confirmativo para coliformes totais, transferiu-se uma alçada de inóculo da cultura para tubos de Caldo E. coli contendo tubos de Durhan. Incubou-se os tubos a 45ºC por 24 horas e observou-se se houve crescimento com produção de gás. Após confirmação do crescimento, determinou-se o número mais provável de coliformes termotolerantes analisando a tabela de número mais provável.