Técnicas Exames

TÉCNICAS SOROLÓGICAS DE USO MAIS COMUM NOS LABORATÓRIOS DE ANÁLISES CLÍNICAS

As técnicas sorológicas são de grande importância no diagnóstico de modo geral pelo fato de pesquisarem no indivíduo a presença de imunocomplexos (Ag-Ac, Ag-Ac-Co) imunoglobulinas ou anticorpos (principalmente IgG) indicativa de infecção aguda ou crônica, IgM (indicativa de infecção aguda ou recente) ou de outras classes tais como IgA (indicativa de infecções que afetam o trato digestivo) ou IgE (indicativa de processos alérgicos), específicas ou reativas a determinado antígeno (agente infeccioso).

As técnicas sorológicas mais empregadas em análises clínicas são a técnica de Ezyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Hemaglutinção Indireta (HAI) e Imunofluorecescência Indireta (IFI).

Pelas razões acima citadas, os  testes sorológicos são frequentemente usados no diagnóstico por duas razões principais:

1. Confirmação de suspeita clínica de infecções crônicas causadas por agentes infecciosos quando estes se encontram em baixa concentração no paciente ou de difícil detecção.

1. Por serem de alta sensibilidade, especificidade e de fácil reprodutibilidade além de poder ser automatizado (ELISA e HAI), o que determina um baixo custo operacional, rapidez e simplicidade de execução.  

Por apresentarem as características descritas acima os testes sorológicos são também comumente empregados em inquéritos sorológicos (estudos de prevalência de doenças, bancos de sangue (triagem sorológica),  impacto de programas de controle de uma determinada doença em uma região, avaliação pós-tratamento, etc.

Parâmetros empregados na avaliação das técnicas sorológicas:

1. Sensibilidade da prova - é a capacidade de um exame se apresentar positivo quando o paciente é realmente portador da doença que se investiga (VP/VP+FN);

1. Especificidade - é a capacidade de um exame dar negativo quando o paciente não está doente (VN/VN+FP);

1.  Eficiência - quando se tem concordância dos resultados de indivíduos verdadeiros positivos e verdadeiros negativos com indivíduos com e sem infecção, na população estudada (VP+VN/VP+VN+FP+FN);

1. Reprodutibilidade - é a capacidade de obtenção de resultados com valores muito próximos entre si, quando se testa uma mesma amostra em diferentes ensaios (R);

1. Valor preditivo positivo - é a capacidade de um exame positivo representar um paciente verdadeiramente portador da doença/infecção pesquisada (VP);

1. Valor preditivo negativo - é a capacidade de um exame negativo representar um paciente sadio ou sem a infecção/doença (VN);

1. Ponto de corte (“cut off”) - o ponto de corte de um teste sorológico é o valor que define o limite entre um teste positivo e um negativo. A escolha deste limiar leva em consideração as frequências dos resultados observados nos testes de uma população em geral, bem como os de especificidade e de sensibilidade de um teste.

Os testes sorológicos em geral pesquisam o anticorpo e são, portanto denominados indiretos, pois detectam a presença do anticorpo indicativa de uma infecção/doença. Estes são os mais usados devido a sua maior sensibilidade. Eles empregam o uso do conjugado, um reagente composto de IgG, IgM ou outra imunoglobulina associada ou marcada com um reagente fluorescente (IFI) ou de cor (Peroxidase ou outro) que na presença de um substrato adequado, resulta na coloração que é lida em um espectrofotômetro. O resultado é expresso em absorbância ou densidade ótica (técnica de ELISA).

Os testes sorológicos diretos pesquisam o antígeno. São de alta especificidade, porém de menor sensibilidade, podendo ser falso-negativo quando o agente  infeccioso existe em baixa concentração na amostra biológica do paciente. São por estas razões de uso muito menos frequente.

Cuidados mais importantes no uso de testes sorológicos:

1. Procedência e qualidade do antígeno: todo antígeno tem um modo de preparo, de uso, de conservação enquanto em uso e um tempo de duração. Todas as recomendações devem ser rigorosamente seguidas para evitar problemas e resultados falso-positivos ou falso-negativos. Em geral a fluorescência do antígeno é vista na membrana. No caso de protozoários uma fluorescência difusa indica má qualidade ou vencimento de validade do antígeno.

1. Procedência e qualidade do conjugado: Há marcas mais indicadas e seguras.

1. Limpeza de plástico e vidrarias: Todo material deve ser cuidadosamente lavado fazendo o uso de sabão neutro para evitar resultados falso-negativo na IFI se o pH estiver elevado.

1. Anotar detalhadamente o esquema de montagem das lâminas ou placas de acordo com a reação distribuição dos controles Pos, Neg, e de cada amostra biológica de cada paciente. Incluir data, Ag, Conjugado, etc. Usar este esquema na hora de ler a reação e anotar os resultados correspondentes a cada lâmina ou placa.

1. Trabalhar em condições de silêncio e privacidade para evitar qualquer engano ou erro de pipetagem de reagente, diluição de soro ou reagentes, local de aplicação de amostras nas lâminas ou placas.

1. No caso da IFI verificar temporariamente o pH da glicerina que se usa  na montagem da lâmina para leitura ao microscópio. Ele deve estar próximo de 7,0. Quando muito baixo a fluorescência da reação não pode ser vista.

HEMAGLUTINAÇÃO INDIRETA – HAI (CHAGATEST HAI/WIENER lab.)

Mecanismo de Ação:

[pic 1]

1. Preparo do diluente de amostras:

• Pipetar 1 mL de diluente/tampão + 40 µL de solução proteica em uma barquinha e homogeneizar;

1. Diluição das amostras – Primeira Placa

• Identificar na placa e em folha as amostras e os controles P e N em seus respectivos poços;
• Homogeneizar no vortex as amostras (descongelando);
• Pipetar 50µL das amostras e controles para cada poço na placa em “V” na proporção de 1:40 (soro/diluente – itém 1)

1. Aplicação do antígeno – Segunda Placa

• Homogeneizar o antígeno HAI A-V por inversão.

• Pipetar 25 µL em cada poço com a amostra e agitar levemente na horizontal por 30 segundos;
• Descansar em temperatura ambiente por 60 minutos.

Leitura

Negativo: Imagem na forma de ponto vermelho escuro central, pois ocorreu sedimentação natural de hemácias.