Coloração de Gram

1. Introdução

A maioria dos microrganismos não apresenta cor quando observados ao microscópio óptico. Para serem visualizados, com maior clareza, eles devem ser corados. Existem inúmeros métodos para coloração. Porém, antes de ser corado, o microrganismo deve ser fixado à lâmina, através de secagem por simples exposição ao ar ou secagem na chama.

A Coloração de Gram foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista dinamarquês Hans Christian Gram. A Coloração de Gram é um dos métodos mais úteis, pois classifica as bactérias em dois grandes grupos: gram-positivos e gram-negativas. A técnica de Gram é fundamental para a taxonomia e identificação das bactérias, sendo muito utilizada atualmente, como técnica de rotina em laboratórios de bacteriologia.

O método de Coloração de Gram consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido, com um corante primário, o cristal violeta, seguido pelo fixador, o lugol.

Para a realização da Coloração de Gram segue-se os procedimentos:

• um esfregaço fixado pelo calor é recoberto por um corante denominado púrpura (cristal violeta). Onde, após a impregnação de todas as células pelo corante, ela é denominada coloração primária.

• após um período, o corante púrpura é lavado e o esfregaço é recoberto com iodo. Quando o iodo é lavado, as bactérias gram-positivas e gram-negativas aparecem em cor violeta escura ou púrpura.

• a lâmina é lavada com álcool ou uma solução álcool-cetona. Onde essa solução é um agente descolorante, que remove a púrpura das células de algumas espécies (não de todas).

• o álcool é lavado e a lamina é corada com safrinina (corante vermelho). O esfregaço é lavado novamente, seco com papel e examinado microscopicamente.

O corante púrpura e o iodo que se combinam no citoplasma de cada bactéria, onde, as bactérias que retém essa cor púrpura ou violeta escura após tentativa de descoloração com álcool, é denominada gram-positivas. E as bactérias que perdem a cor violeta escura ou púrpura após descoloração, são denominadas gram-negativas. As bactérias gram-negativas são incolores após a lavagem com álcool e, por esta razão, o corante safranina é aplicado, corando-as de rosa.

O que difere, estruturalmente, as bactérias gram-positivas das gram-negativas é que as bactérias gram-positivas possuem uma parede celular de peptideoglicano mais espessa (dissacarídeos e aminoácidos); já as bactérias gram-negativas contém uma camada de lipopolissacarídeo (lipídeos e polissacarídeos) como parte de sua parede celular. As bactérias gram-positivas tendem a ser mortas mais facilmente por penicilinas e cefaloposrinas e as bactérias gram-negativas são mais resistentes, pois os antibióticos não podem penetrar na camada de lipopolissacarídeo.

Quanto aos tipos de coloração temos:

1. Coloração simples – cuja proposta é apenas tornar a forma e estrutura básica das células mais visíveis.
2. Coloração diferencial – nesta coloração o corante reage diferencialmente com diferentes tipos de bactérias. A coloração de Gram e a álcool – ácido resistente são exemplos de colorações diferenciais.
3. Coloração especial – são aquelas utilizadas para corar e identificar partes específicas dos microrganismos como esporos, flagelos ou ainda revelar a presença de cápsulas.

1. Objetivo

Desenvolver habilidades para executar as técnicas de preparação de esfregaços e para o método de coloração de Gram, sabendo diferenciar e classificar as bactérias de acordo com a coloração obtida e relacionando-as à composição química da parede celular das mesmas. Desenvolver a habilidade, também, para utilizar o microscópio óptico, observando as bactérias após a coloração de Gram.

1. Materiais

• Bico de Bunsen

• Cristal Violeta

• Lugol

• Microscópio

• Óleo de imersão

• Solução de Álcool-Acetona (v/v)

• Água destilada

• Safranina

• Pinças

• Piceta

• Suporte para lâminas

• Solução Fisiológica (NaCl à 0,9%)

• Lâminas limpas e desengorduradas

• Alças de inoculação

• Agulhas

• Forma de alumínio

• Microrganismos:

Streptococcus agalactiae

Staphylococcus aureus

Neisseria gonorrhoeae

Bacillus megaterium

Escherichia coli

Enterococcus faecalis

Lactobacillus casei

Candida albicans

1. Procedimento

• Preparar esfregaços a partir de culturas puras de
• Corar os esfregaços pelo método de coloração de Gram
• Observar ao microscópio e identificar os microrganismos frente ao método de Gram.

4.1 Preparo do esfregaço

• Sobre uma lâmina limpa adiciona-se uma gota de solução salina. Com a alça bacteriológica devidamente flambada, coleta-se o inoculo do meio de cultura e espalha-se o mesmo na lâmina junto à solução salina, com o auxilio da alça, obedecendo às regras de biosseguranças necessárias.
• Flambar a alça bacteriológica, esfriar, abrir a placa de Petri com a cultura e tocar a colônia escolhida para retirada da amostra.
• Esfregar o material com movimentos de rotação da alça bacteriológica para se obter um esfregaço fino e uniforme.
• Deixar secar nas proximidades da chama.
• Fixar o esfregaço passando a lamina três vezes na chama do Bico de Bunsen, rapidamente.

4.2 Preparo da coloração de Gram

• Após o esfregaço preparado, adiciona-se o cristal violeta de modo a cobrir todo o esfregaço durante um minuto e, posteriormente, decorrido o tempo, lava-se o esfregaço com água destilada para a retirada do excesso de cristal violeta da amostra
• Lavar rapidamente em água destilada.
• Cobrir a lamina com solução de lugol, com função mordente, ou seja, aumenta a afinidade do corante pela célula, de modo a cobrir todo o esfregaço durante um minuto.
• Após, acrescenta-se o álcool-cetona para que as células descorem mais facilmente. Esta ação deve ser rápida e precisa, devendo levar de cinco a dez segundos.
• Lava-se em água corrente a lâmina após a adição do álcool-cetona e acrescenta-se safranina, um corante secundário que cora as células descoradas com o a solução álcool-cetona. Esta ação decorrerá em trinta segundos.
• Lavar a lâmina em água destilada e secar delicadamente.
• Colocar uma gota de óleo de imersão sobre a lâmina e observar no microscópio.

1. Resultados

5.1 Streptococcus agalactiae[pic 1]

Gram-positiva

5.2 Staphylococcus aureus[pic 2]

Gram-positiva.

5.3 Neisseria gonorrhoeae