EDIÇÃO GENÔMICA POR CRISPR-CAS9 E SEU POSSÍVEL USO COMO SOLUÇÃO PARA CARDIOPATIAS CONGÊNITAS NO BRASIL.

EDIÇÃO GENÔMICA POR CRISPR-CAS9 E SEU POSSÍVEL USO COMO SOLUÇÃO PARA CARDIOPATIAS CONGÊNITAS NO BRASIL.

Leonardo Silva de Almeida¹

Jefferson Brito Martins dos Santos¹

Laís Neiva Rego Siqueira¹

Thaline Ravena Nunes Costa¹

Orientador (a): Prof.ª Dr.ª Daniela Moura Parente²

RESUMO:        

Anomalias congênitas são causas importantes de mortes infantis, doenças crônicas e deficiências, sendo as mais comuns e graves, defeitos cardíacos e malformações do tubo neural. Contudo, essas deformidades podem ser causadas por alterações genéticas diretas ou indiretas (onde há a influência dos fatores ambientais). Tendo por base essas informações, desenvolveu-se a tecnologia de “edição genômica” uma vez que funciona através da modulação da expressão de genes, a CRISPR, sigla em inglês para Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, que traduzindo para o português fica Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas. O presente trabalho possui por finalidade, descrever o procedimento e avaliar as possibilidades do uso de tal técnica na prevenção e profilaxia de diferentes anomalias congênitas, dando ênfase no cenário cardiológico.

ABSTRACT:

Congenital anomalies are important in childhood deaths, chronic diseases and disabilities, being more common and severe, cardiac defects and neural tube malformations. However, these deformities may be caused by direct or indirect genetic portals (where there is an influence of environmental factors). Based on this information, "genomic editing" technology has been developed since it works by modulating gene expression, a CRISPR, for Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, which translates into Portuguese. Short Palindromic Repetitions Grouped and Regularly Interspaced. The purpose of this study was to describe the procedure and evaluate the possibilities of technical use in the prevention and prophylaxis of different congenital anomalies, with emphasis on cardiology.

INTRODUÇÃO:

O desenvolvimento da tecnologia de DNA recombinante na década de 1970 marcou o início de uma nova era para a biologia. Pela primeira vez, os biólogos moleculares ganharam a capacidade de manipular moléculas de DNA, possibilitando o estudo de genes e aproveitá-los para desenvolver novos medicamentos e biotecnologias (HSU; LANDER; ZHANG, 2014). Tudo começou, segundo Lander 2016, quando Francisco Mojica "encontrou uma estrutura curiosa - várias cópias de uma sequência quase perfeita, aproximadamente palindrômica, repetida de 30 bases, separadas por espaçadores de aproximadamente 36 bases - que não se assemelhavam a nenhuma família de repetições conhecida em micróbios", trabalhando com Haloferax mediterranei, em 1989, e em H. volcanii, duas espécies do reino archaea. Penteando através da literatura científica, ele também detectou uma conexão com eubactéria quando o primeiro relatório de sequências de repetição palindrômica intercaladas foi feito por Ishino et al. que relataram repetições curiosas de 29 pb interespaçadas por cinco sequências não-repetitivas intervenientes de 32 pb perto do gene iap de Escherichia coli (LANDER, 2016; SANTOS, 2014).

Observou-se que a estrutura genética do CRISPR no sistema bacteriano consiste em repetições palindrômicas curtas, agrupadas e regularmente intercaladas (AREND, 2016). Lander 2016, ainda relata que, somente em 2 anos após as pesquisas de locus CRISPR em 20 procariontes diferentes por Mojica, os pesquisadores dobraram o recenseamento e catalogaram as principais características dos loci, incluindo a presença de genes específicos associados a CRISPR (cas) nas imediações, que estavam presumivelmente relacionados à sua função, e que, desde 2000 até hoje, a classificação dos sistemas CRISPR foi modernizada. Portanto, pode-se notar que, de acordo com Nicholson 2016, identificar uma ferramenta para mudar o genoma começou como um sussurro, mas hoje parece haver uma tecnologia com potencial genuíno para revolucionar o campo da engenharia genômica.

Diante disso, o RNA-guiado por Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas ou CRISPR associada a proteína 9 ou sistema CRISPR-Cas9 é muito mais simples e adaptado para a edição do genoma de mamíferos. O Cas9 é bioengenharia para melhor localização de núcleos e expressão de células de mamíferos (HUANG; NAIR, 2017). Dessa forma, o sistema CRISPR possibilita uma edição do gênero através de clivagem do DNA por uma endonuclease (Cas9), guiada a partir de uma sequência de RNA, que é capaz de se parear com como base de uma sequência alvo (AREND, 2016). Os genes associados à repetição palindrômica (CRISPR) associadas ao agrupamento periódico (CRISPR) emergiram como uma nova classe de endonucleases específicas de sequência com flexibilidade sem paralelo, custo-eficácia e facilidade de aplicação (Nicholson, 2016).

Logo CRISPR logo foi adaptado para uma vasta gama de aplicações - criando modelos animais complexos de doenças e cânceres hereditárias humanas; realizando telas de genoma em células humanas para identificar os genes subjacentes aos processos biológicos - e está sendo usado em milhares de laboratórios em todo o mundo (LANDER, 2016). Além disso, o uso do CRISPR / Cas9 também tem sido proposto para o estágio embrionário em modelos animais, onde é progênie pode gerar organismos "fundadores" (por recombinação), contendo mutações alélicas que levam ao efeito "nocaute" ou de expressão diminuída (AREND, 2016). Embora Cas9 já tenha sido amplamente utilizado como ferramenta de pesquisa, uma direção futura particularmente interessante é o desenvolvimento de Cas9 como uma tecnologia terapêutica para o tratamento de distúrbios genéticos (HSU, LANDER, ZHANG, 2014). Assim, conciliando sofisticadas técnicas moleculares e biotecnológicas, o sistema CRISPR / Cas9 foi proposto para aplicação em edição genômica e hoje já está disponível para milhares de alvos (AREND, 2016).

Isto posto, averiguando as patologias que requisitam o uso da CRISPR é evidente que, segundos dados epidemiológicos da Organização Mundial de Saúde (OMS) 2016, as doenças cardiovasculares (DCV) representam a maior causa de mortes em todo o globo. Sob essa perspectiva, atualmente já existem muitos laboratórios de pesquisa que estão utilizando a ferramenta CRISPR/Cas9 para editar genes envolvidos com DCV e testando em sistemas celulares, realizando ensaios pré-clínicos e projetando estudos clínicos (AREND, 2016).  Por exemplo, temos a doença hereditária do sistema cardiovascular, chamada Cardiomiopatia Hipertrófica (HCM), que é clinicamente um distúrbio do músculo cardíaco autossômico, dominante, heterogêneo e com etiologia hereditária que ocorre predominantemente em genes que codificam proteínas dos sarcômeros de cardiomiócitos, que são o aparelho contrátil dessas células (SANTOS, 2014). Em vista disso, não apenas o contexto inibitório, mas a possibilidade de edição para ativação de genes de maneira a estimular funções relacionadas, por exemplo, à sobrevivência de cardiomiócitos no pós-infarto, aumento do nível de proteínas que levam ao remodelamento ventricular patológico, além de outros mecanismos, pode vir a ser explorada das DCV (AREND, 2016). No contexto da HCM evidências experimentais e clínicas demonstram que a segmentação de caminhos de HCM pode melhorar o tratamento convencional. Por isso, uma abordagem molecular inovadora pode ser necessária para desenvolver novas estratégias terapêuticas para pacientes com HCM (SANTOS, 2014). Assim, de acordo com Arend 2016, diante das estratégias levantadas e de tantas outras do sistema CRISPR/Cas-9 a possibilidade de uso dessa nova ferramenta molecular na Cardiologia pode ser vislumbrada e talvez, em um futuro próximo, vir a beneficiar a saúde da população.