Espectrofotometria

1. INTRODUÇÃO

1.1 Princípios básicos

A espectrofotometria visível e ultravioleta é um dos métodos analíticos mais utilizados nas determinações analíticas em diversas áreas. É aplicada para determinações de compostos orgânicos e inorgânicos, como, por exemplo, na identificação do princípio ativo de fármacos.

A região ultravioleta do espectro é geralmente considerada na faixa de 200 a 400 nm, e a região do visível entre 400 a 800 nm. As energias correspondentes a essas regiões são ao redor de 150 a 72 k.cal.mol-1 na região ultravioleta, e 72 a 36 k.cal.mol-1 para a região visível. Energias dessa magnitude correspondem, muitas vezes, à diferença entre estados eletrônicos de muitas moléculas.

A absorção da região visível e ultravioleta depende, em primeiro lugar, do número e do arranjo dos elétrons nas moléculas ou íons absorventes. Como consequência, o pico de absorção pode ser correlacionado com o tipo de ligação que existe na espécie que está sendo estudada.

De um ponto de vista prático, o aspecto mais importante do cálculo quântico é a determinação de quanta luz é absorvida pela amostra. Isto é descrito pela lei de Beer- Lambert, que dá a relação entre a intensidade da luz incidindo na solução (I0), e a intensidade da luz saindo da solução (I).

wqLog (I0/ I) = A = cl

A= absorbância

= absorvidade molecular ou coeficiente de extinção

c= concentração do material absorvedor

l= espessura da amostra da amostra através da qual a luz passa.

A absorção pelos compostos orgânicos e inorgânicos é relacionada com uma deficiência de elétrons na molécula. Nos inorgânicos, o comprimento de onda de absorção das transições “d-d” depende do metal envolvido, do número de grupos coordenados, da basicidade, dos átomos doadores e da geometria dos grupos coordenados.

Nos compostos orgânicos, os que possuem dupla ligação absorvem fortemente no ultravioleta remoto. Os compostos que possuem ligações simples e duplas alternadamente, chamadas de ligações conjugadas, produzem absorção em comprimentos de ondas maiores. Quanto mais extenso for o sistema conjugado, mais longos serão os comprimentos de onda absorvidos, podendo chegar à região do visível.

Com alguma frequência é necessário quantificar substâncias em misturas complexas, ou que não absorvem significativamente a luz a nenhum comprimento de onda. Nestes casos utilizam-se os chamados métodos colorimétricos, o composto a quantificar é posto em contato com um reagente específico, de modo a desenvolver uma cor cuja intensidade é diretamente proporcional à concentração da substância na mistura original.

Por exemplo, para quantificar proteínas numa solução pura pode medir-se a absorvência a 280µm, sendo esta proporcional à concentração de proteína. Mas caso se queira saber a concentração de proteína num extrato impuro, este método já não pode ser utilizado, porque outras substâncias, como por exemplo, os ácidos nucleicos, também absorvem a este comprimento de onda.

Neste contexto, várias reações foram desenvolvidas das quais detectam, especificamente, a presença de biomoléculas em soluções desenvolvendo colorações variadas. Assim, tais reações puderam ser utilizadas para a determinação qualitativa e quantitativa de biomoléculas em diversas amostras, sendo então aplicadas às análises clínicas para diagnóstico de diabetes, lipidemias, colesterolemias, proteinúrias, e produtos nitrogenados como o ácido úrico, uréia e amônia, enzimas como amilase, lipase, fosfatase alcalina, fosfatase ácida, aminotransferases, lactato desidrogenase, entre outras, além de íons como cálcio, potássio e sódio. Abaixo se encontram alguns métodos pelos quais pode-se determinar a bilirrubina, glicose e proteínas totais, substâncias estas, que foram utilizadas em demonstração prática.

1.2Determinação de glicose pelo método da O-toluidina

Nesse método a glicose reage com a o-toluidina (orto-toluil) em meio ácido e a quente, resultando glicosamina e base de Schiff correspondentes. Esta reação desenvolve cor azul que é proporcional à quantidade de glicose até 200 mg/dL presente na amostra que pode ser soro, plasma, urina ou liquor. Os valores normais do soro ou plasma é de 75 a 110mg/dL, sangue total de 80 a 120 mg/dL e urina zero (ausente) e a leitura espectrofotométrica é feita entre 600 a 650 nm. (CISTERNAS et al., 2005, p. 13).

1.3 Determinação de Proteínas Totais pelo Método do Biureto

A reação do biureto é característica para identificação de proteínas, sendo positiva quando há no mínimo três ligações peptídicas (NEPOMUCENO e RUGGIERO, 10 2004, p.99). O biureto é formado pelo aquecimento da uréia a 180ºC, havendo a liberação de uma molécula de amônia. Soluções fortemente alcalinas de biureto, em presença de sulfato de cobre diluído, desenvolvendo uma coloração violeta. A coloração desenvolvida deve-se à formação de um complexo entre o íon cúprico (Cu*2) e quatro átomos de nitrogênio. As proteínas dão positiva a reação pela existência das várias ligações peptídicas, formando-se o complexo entre duas cadeias adjacentes (HIRANO et al., 2001, p.81). O complexo formado entre o íon cúprico e as múltiplas ligações peptídicas das proteínas apresenta um ponto máximo de absorbância em 545nm (filtro verde do equipamento) (CISTERNAS et al., 2005, p. 16).

1.4 Determinação de Bilirrubina

A degradação do grupo hemo, provém em 80 a 85% das hemácias envelhecidas, destruídas, após quatro meses, no sistema reticulendotelial, e, em 15 a 20%, de hemoproteínas hepáticas assim como de hemácias em maturação na medula óssea. A oxidação do hemo leva à síntese de biliverdina e depois da bilirrubina. (KAMOUN et al., 2006, p. 330).

A bilirrubina é transportada para o fígado, onde sofre uma conjugação com glicuronato, tornando-a solúvel. Sua eliminação é feita normalmente pelas vias biliares. No intestino, a bilirrubina sofre, por influência das bactérias intestinais, uma série de transformações que levam aos pigmentos biliares (STRYER, et al., 2008, p. 708).

O conjugado de bilirrubina é pouco absorvido pela mucosa intestinal. No íleo terminal e intestino grosso, o diglicuronídeo de bilirrubina é hidrolizado para formar bilirrubina livre e ácido glicurônico. Esta bilirrubina livre é então reduzida pela