Coloraçao de gram

                                 INTRODUÇÃO:

     A coloração de Gram é um dos mais importantes métodos  O método de coloração de Gram, quando bem administrado é eficaz, pelo fato de facilitar a identificação e diferenciação de colônias de bactérias Gram positivas e Gram negativas. Os objetivos desta prática foram alcançados, pois ao visualizar no microscópio óptico, foi possível a identificação de bactérias coradas de rosa avermelhado, cuja característica pertence a bactérias do grupo Gram negativas as de coloração que sao utilizados em laboratórios de microbiologia, sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterização de amostras de bactérias. Esta coloração foi desenvolvida pelo médico dinamarquês Hans Cristian Gram em 1884. O objetivo deste médico era permitir a separação de amostras bacterianas em positivas e negativas, determinando assim a morfologia e o tamanho das bactérias analisada.Que para isto ele utilizou a técnica do esfregaço bacteriano, fixado pelo calor em uma lâmina, e colocou os reagentes: cristal violeta1, lugol2, éter-acetona3 e fucsina básica4 ou safranina5 além da água destilada.Este método depende da capacidade da parede celular de bactérias Gram positivas de absorver o corante cristal violeta mesmo com o tratamento com éter-acetona, enquanto as Gram negativas não o fazem. Isto ocorre, pois as bactérias Gram negativas têm apenas 10% da parede composta por peptideoglicano (estrutura que confere rigidez a parede celular de bactérias, determina a forma da bactéria e a protege da lise osmótica, quando em meio hipotônico) e, além disto, possuem uma membrana externa cobrindo esta camada. Já as positivas possuem em sua parede cerca de 90% de peptídeoglicano.Tanto as bactérias Gram-positivas quanto Gram-negativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o mordente, adquirindo coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo, insolúvel, em seus citoplasmas.Seguindo o tratamento o solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido, descorando as células.

    Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Gram-positivas e provoca a contração dos poros do peptídeoglicano, tornando-as impermeáveis ao complexo; o corante primário é retido e as células permanecem coradas.Em seguida, a amostra é tratada com um corante secundário, a fucsina básica (ou safranina). Ao microscópio, as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro.

A exposição prolongada ao solvente irá provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias, podendo produzir resultados falsos.

positivas e provoca a contração dos poros do peptídeoglicano, tornando-as impermeáveis ao complexo; o corante primário é retido e as células permanecem coradas.

   Que em seguida, a amostra é tratada como um corante secundário, a fucsina básica (ou safranina). Ao microscópio, as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro.

A exposição prolongada ao solvente irá provocar a remoção do cristal violeta dos dois tipos de bactérias, podendo produzir e obtendo  resultados falsos:

• Mordente
• Corante primário;
• (fixador);
• Solvente orgânico;

4 e 5-   Corantes secundários.

OBJETIVO DA PRÁTICA:

   É reconhecer os microrganismos presentes na lâmina a ser confeccionada, por meio da coloração de Gram, indicando se os mesmos eram Gram positivos ou Gram negativos. Demonstrar a importância da coloração de Gram e estabelecer a distinção entre eles:

-Bactérias Gram-positivas e Gram-negativas;

-As morfologias cocos, bacilos;

-Arranjos bacterianos (estafilococos, estreptococos, etc.;

- Leverduras

                                              MATERIAIS E MÉTODOS:

Materiais:

Lâmina de microscopia;

Alça de Platina;

Bico de Bunsen;

Papel toalha;

Microscópio óptico.

Procedimentos:

Preparo do esfregaço – Escolheu-se uma colônia para ser analisada e transferiu-a para a lâmina com auxílio da alça de Platina, sempre perto do bico de Bunsen para evitar contaminação. Essa porção da amostra bacteriana a ser corada foi misturada com uma gota de solução salina (0,85%), sobre a lâmina.

Aplicação dos corantes:

• Cobriu-se toda a sua superfície da lâmina com o corante cristal violeta; deixando em repouso por um minuto. Descartou-se o excesso de corante ou enxaguou-se a lâmina com água.
• Cobriu-se toda a sua superfície da lâmina com Lugol; deixando em repouso por um minuto. Descartou-se o excesso do fixador ou enxaguou-se a lâmina com água.
• Com a lâmina inclinada, despejaram-se algumas gotas de álcool-acetona. Este procedimento não pode ser excedido por cinco segundos, podendo assim remover o corante cristal violeta das células Gram-positivas. Em seguida, enxaguou-se a lâmina com água para remover excesso de solvente.
• Cobriu-se toda a sua superfície da lâmina com o corante fucsina básica; deixando em repouso por um minuto. Enxaguou-se a lâmina com água, limpando assim as bordas com papel absorvente para remoção do excesso de água.

Microscopia – examinou-se a amostra ao microscópio óptico, utilizando a objetiva de imersão para observação final. Ao final da avaliação a objetiva foi limpa com auxílio do álcool isopropílico.