Microbiologia 2016

1. INTRODUÇÃO

Dentre os produtos cárneos, a carne moída é um alimento que se destaca entre os demais, uma vez que é bem aceita pelo consumidor, devido a sua praticidade, preço acessível e poder ser utilizada de diversas maneiras na culinária. Ela constitui também um meio altamente favorável para multiplicação bacteriana. Existem diversas fontes de contaminação da carne, dentre elas, destacam-se o abate do animal, tempo e temperatura de estocagem nos pontos de venda e varejo, higienização dos equipamentos e excesso de manipulação(PARDI,2001; PIGARRO,2008).

Para avaliação de qualidade sanitária de alimentos são utilizados microorganismos indicadores de contaminações. Entre eles estão os coliformes totais e os termotolerantes. Os coliformes totais são compostos por bactérias da família Enterobacteriaceae, capazes de fermentar a lactose com produção de ácido e gás, quando incubados a 35-37ºC, por 48 horas. São bastonetes Gram-negativos, não formadores de esporos, aeróbios ou anaeróbios facultativos (RAY, 1996).

Pertencem a este grupo predominantemente, bactérias dos gêneros Escherichia, Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella. Entre essas, apenas a Escherichia coli se desenvolve no trato intestinal do homem e animais. Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella, além de serem encontrado nas fezes, também podem estar presentes em outros ambientes como vegetais e solo, onde persistem por tempo superior ao de bactérias patogênicas de origem intestinal como Salmonella e Shigella. Reconhecida como patógeno de origem alimentar a Escherichia coli é  uma bactéria gram-negativa, anaeróbia facultativa, não esporulada, da família  Enterobacteriaceae. Todavia, a presença de coliformes totais no alimento não indica, necessariamente, contaminação fecal recente (LANDGRAF, 2003;SIMM,2012).

Já coliformes termotolerantes, são as bactérias pertencentes ao grupo das coliformes totais são considerados enteropatógenos e encontrados em fezes de animais de sangue quente  que apresentam a capacidade de continuar fermentando lactose com produção de gás, quando incubadas à temperatura de 44,5-45,5ºC. Nessas condições, ao redor de 90% das culturas de Escherichia coli são positivas, enquanto entre os demais gêneros, apenas algumas cepas de Enterobacter e Klebsiella mantêm essa característica SILVA, 2007; FRANCO,2003).

Micro-organismos indicadores incluem espécies que quando presentes em um alimento ou na água podem indicar contaminação de origem fecal, possibilidade da presença de patógenos ou deterioração do alimento, bem como indicar falhas nas condições sanitárias, que podem ocorrer desde o processamento até o armazenamento. Assim, o objetivo do experimento é estimar a população de coliformes totais e de coliformes termotolerantes nas amostras de carne moída através do número mais provável (NMP) e confirmar se os coliformes encontrados pertencem ao gênero de Escherechia Coli. (FRANCO, 2003). 

2. METODOLOGIA

No experimento foram feitas as higienizações necessárias. Cumprindo os devidos procedimentos assépticos. Esterilizando-se o balcão usado para manipulação da amostra e a higienização da mão. Todos com álcool 70%, caracterizando um ambiente quase que completamente livre de microorganismos. Foram realizadas as manipulações para a preparação da amostra logo em seguida uma prova presuntiva foi realizada dando início aos testes de confirmação para coliformes totais e coliformes termotolerantes.

De início, fez-se a homogeneização da amostra. Misturando assepticamente 225 mL de água peptonada e 0,2 gramas da amostra, com agitação de 2 min em Stomacher. Sendo essa a diluição de 10-1. Transferiu-se assepticamente volumes de 1,0 mL da amostra para 9,0 mL de diluente obtendo a diluição 10-2. Para a preparação da diluição de 10-3, transferiu assepticamente 1,0 mL da diluição de 10-2 para 9,0 mL de diluente. No teste presuntivo três alíquotas de cada diluições da amostra foram inoculadas em uma série de nove tubos de caldo lauril sulfato triptose(LST). Em seguida, incubou-se os tubos em banho a 35°C por 24 horas, com observância na presença de coliformes totais que é confirmada pela formação de gás e turvação do meio ou efervescência quando agitado lentamente. A seguir, na Figura 1 estão apresentados os procedimentos desde a amostra embalada até a incubação dos tubos de caldo lauril sulfato triptose.  

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Figura 1: Teste presuntivo em triplicata nas diluições 10-1,10-2  e 10-3

A partir dos tubos com formação de gás, semeou-se por alçada em tubos contendo caldo de bílis (VB) onde incubou-se os mesmos a 35oC por 48 horas. A possível formação de gás constituI  teste positivo para coliformes totais.

Também através dos tubos positivos do teste presuntivo, transferiu-se com uma alça de platina uma pequena porção do meio para o mesmo número de tubos contendo caldo EC (Escherichia coli), posteriormente, incubou-se os mesmos a 44,5°C por 48h. A presença de gás no interior dos tubos de Durhan é considerada uma reação positiva, indicadando contaminação de origem fecal.

Para a detecção de Escherichia coli em cada tubo de caldo EC com produção de gás estriou-se uma alçada de cultura nas placas de Àgar Eosina Azul de Metileno (EMB), incubando-as aproximadamente à 35°C durante 24h e observou-se se houve desenvolvimento de colônias típicas de E. coli (nucleadas com centro preto, com ou sem brilho metálico). Na confirmação de colônias típicas, transferiu-se duas colônias bem isoladas de cada placa para tubos de Ágar Padrão Contagem (PCA), inclinados, incubando-se os tubos a aproximadamente 35°C por 24h. A próxima etapa iniciou-se a partir das culturas puras em PCA, na qual fez-se o teste de coloração Gram, inoculando-se os meios para realização de provas bioquímicas de VM e VP e citrato. A Figura 2 estão representados os materiais utilizados para a deteção dos coliformes totais e termotolerantes(VB E EC) a partir do teste presuntivo.