Cinética Enzimática

Aluna: Mariana da Silva Mello Nogueira Contreiras Cesar / 13214070077 / São Gonçalo

Relatório da Prática 2 de Química V – Cinética Enzimática

1. Introdução:
2. Procedimento Experimental:  

EXPERIMENTO 3: Determinação da curva padrão

1°) Foi pesado (0,0905±0,0001) g de glicose, com auxílio de um vidro de relógio, e foi colocada num béquer de 100 mL;

2°) Foi acrescentado a esse béquer, 50 mL de solução tampão (acetato de sódio), com auxílio de uma proveta de 50 mL;

3°) Seguiu-se o protocolo abaixo, com auxílio de pipetas graduadas de 1 mL:

Tubo	Tampão (mL)	Solução Padrão (mL)
1	1	0
2	0,9	0,1
3	0,8	0,2
4	0,7	0,3
5	0,6	0,4
6	0,5	0,5
7	0,4	0,6
8	0,3	0,7
9	0,2	0,8
10	0,1	0,9

4°) Foi adicionado a cada tubo de reação 1 mL do reativo DNS, com auxílio de uma pipeta graduada de 1 mL, e homogeneizou a solução;

5°) Foi colocado os tubos em banho fervente à 100 °C, por 5 minutos;

6°) Foi resfriado os tubos e adicionou-se 8 mL de água destilada, com auxílio de uma proveta de 10 mL; e

7°) Foi colocada uma amostra de cada tubo no espectrofotômetro para leitura de absorvância.

EXPERIMENTO I - Efeito da concentração de enzima na velocidade inicial da reação

1°) Foi pesado (0,6894±0,0001) g de enzima, com auxílio de um vidro de relógio, e foi colocada num béquer de 100 mL;

2°) Foi acrescentado a esse béquer, 10 mL de solução tampão (acetato de sódio), com auxílio de uma proveta de 10 mL;

3°) Seguiu-se o protocolo abaixo, com auxílio de pipetas graduadas de 1 mL:

Tubo	Tampão (mL)	Enzima (mL)
1	0,6	0
2	0,5	0,1
3	0,4	0,2
4	0,3	0,3
5	0,2	0,4

 

4°) Foram colocados os tubos à 30 °C em banho-maria, por 5 minutos;

5°) Foi acrescentado 0,4 mL de sacarose (substrato) em cada tubo;

6°) Foram colocados os tubos à 30 °C em banho-maria, por 10 minutos;

7°) Foi adicionado a cada tubo de reação 1 mL do reativo DNS, com auxílio de uma pipeta graduada de 1 mL, e homogeneizou a solução;

8°) Foi colocado os tubos em banho fervente à 100 °C, por 5 minutos;

9°) Foi resfriado os tubos e adicionou-se 8 mL de água destilada, com auxílio de uma proveta de 10 mL; e

10°) Foi colocada uma amostra de cada tubo no espectrofotômetro para leitura de absorvância.

EXPERIMENTO 2 - Determinação das velocidades da reação em função da concentração de substrato

1°) Foi utilizada mesma solução tampão do Experimento 1;

2°) Seguiu-se o protocolo abaixo, com auxílio de pipetas graduadas de 1 mL:

Tubo	Tampão (mL)	Enzima (mL)
1	0,8	0,2
2	0,7	0,2
3	0,6	0,2
4	0,5	0,2
5	0,4	0,2
6	0,3	0,2
7	0,2	0,2

3°) Foi acrescentado sacarose (substrato) conforme o protocolo abaixo:

Tubo	Sacarose (mL)
1	0,0
2	0,1
3	0,2
4	0,3
5	0,4
6	0,5
7	0,6

5°) Foram colocados os tubos à 30 °C em banho-maria, por 10 minutos;

7°) Foi adicionado a cada tubo de reação 1 mL do reativo DNS, com auxílio de uma pipeta graduada de 1 mL, e homogeneizou a solução;

8°) Foi colocado os tubos em banho fervente à 100 °C, por 5 minutos;

9°) Foi resfriado os tubos e adicionou-se 8 mL de água destilada, com auxílio de uma proveta de 10 mL; e

10°) Foi colocada uma amostra de cada tubo no espectrofotômetro para leitura de absorvância.

1.Em uma estante, preparar 7 tubos de ensaio com as quantidades de tampão e enzima indicadas na Tabela 2 (realizar o ensaio em duplicata). 2.Equilibrar a temperatura dos tubos a 30oC por 5 minutos. 3.Adicionar substrato. 4.Incubar a 30 o C por exatamente 10 minutos. 5.Proceder ao método de dosagem de açúcares redutores 6.Anotar a absorvância a 540 nm na tabela 2. Não despreze o conteúdo dos tubos ainda. Eles ainda serão usados. Tabela 2 Tubo Tampão (mL) Enzima (mL) Sacarose (mL) Absorvância (média das duplicatas) II-1 0,8 0,2 0,0 II-2 0,7 0,2 0,1 II-3 0,6 0,2 0,2 II-4 0,5 0,2 0,3 II-5 0,4 0,2 0,4 II-6 0,3 0,2 0,5 II-7 0,2 0,2 0,6 Obs: 1.Acertar a absorvância zero para o tubo II-1 (branco) em comprimento de onda de 540 nm. 2.Ler a absorvância dos tubos II-2 a II-7 e anotar os resultados na Tabela 7 . Relatório: 1. Descrever, sucintamente, o objetivo da prática (não repita o experimental utilizado). 2. Resultados a serem apresentados no relatório - Apresentar todas as tabelas completas com os resultados experimentais e cálculos - Apresentar o gráfico da curva padrão obtida (absorvância x [sacarose hidrolisada]) - Apresentar os gráficos da velocidade de reação em função do volume adicionado de enzima e de concentração de substrato (Gráfico V X [S] e de 1/V x 1/[S] e cálculo de KM e Vmax em cada gráfico). 3. Questões a serem respondidas no relatório a.Que tipo de curva foi obtida quando se relacionou velocidade com a quantidade de enzima? Explique conceitualmente por que a elevação da concentração da enzima gera um aumento da velocidade inicial da reação. b.Com base nos resultados do experimento II, explique por que não ocorre um aumento significativo da velocidade inicial da reação, após determinada concentração de substrato. c.Existem diferenças entre os resultados de Vmáx e Km obtidos pelo gráfico de Michaelis-Menten e do duplo recíproco (Lineweaver-Burk)? Qual dos gráficos apresenta os resultados mais exatos? Por quê?