Relatório Cinética Enzimática

Introdução

As enzimas são um grupo de proteínas que atuam na aceleração de reações químicas, ou seja, são consideradas catalisadores biológicos de alta especificidade, onde cada uma delas se liga a apenas algum tipo característico de substrato. Elas atuam acelerando a reação em até 106 vezes. Na falta dos catalisadores biológicos, a maioria das reações seria muito lenta para suprir as demandas do metabolismo de um organismo [1]

O substrato e a enzima reagem reversivelmente entre si, formando um composto intermediário denominado complexo enzima‑substrato. Esse complexo formado se decompõe formando o produto da reação e a enzima é regenerada. Portanto, a reação catalisada por uma enzima pode ser representada, simplificadamente, como:

E+S ES E+P

A atividade catalítica de uma enzima está relacionado a sua estrutura tridimensional nativa, onde a enzima apresenta sua atividade biológica que pode ser afetado por fatores de pH e temperatura. Desta forma, cada enzima pode apresentar uma “atividade máxima” em virtude de ótimas condições de pH e temperatura. A atividade enzimática é influenciada diretamente pela ação do tempo. Quanto mais tempo a enzima estiver em contato com o substrato, mais produtos serão produzidos, enquanto houver substrato [1].

Conforme a teoria da cinética química, para ocorrer a reação entre duas moléculas, é necessário a aproximação das moléculas para ser possível a formação de uma ligação entre si, ou “colidir”, e devem possuir energia cinética o suficiente para superar a barreira de energia para atingir o estado de transição. Portanto, as condições que tendem a aumentar a frequência ou a energia de colisão entre os substratos tendem a aumentar a velocidade da reação em que participam [2]

Há alguns fatores que influenciam a velocidade de uma reação catalisada por uma enzima. O calor é um desses fatores: todas as reações ocorrem mais rapidamente em uma temperatura maior, visto que, o aquecimento resulta em um aumento da energia cinética, o que faz que a molécula aumenta sua velocidade e aumente a frequência de colisão. Porém, para as enzimas humanas apresentam uma determinada estabilidade em temperaturas próximas de 45ºC, em temperaturas mais elevadas a propriedade catalitica da enzima pode ser perdida, visto que, em temperaturas muito altas outro fator entra em questão: as ligações de hidrogênio relativamente fracas, que retém as estruturas secundárias na molécula de proteínas se rompem em altas temperaturas, levando à desnaturação da molécula, ocasionando a perda da atividade biológica. A velocidade de uma reação catalisada por uma enzima aumenta gradualmente com o aumento da temperatura, até que alcance um ponto máximo, depois, a velocidade declina [2].

Fonte: Livro bioquímica de Brown, T.A.

O pH é outro fator que também afeta a velocidade da reação de uma forma parecida com a temperatura: o pH também desnatura a proteína em valores extremos de pH, visto que, as forças eletrostáticas dos íons podem alterar a conformação dos aminoácidos da enzima, alterando sua atividade [3].

A cinética enzimática permite-nos representar graficamente o comportamento de uma dada enzima em diferentes condições de concentração de subtrato . A equação que nos elucida sobre esse comportamento é a equação de Michaelis-Menten, cujos valores de Vmáx (velocidade maxima), Vi (velocidade inicial) e Km (costante de Michaelis-Menten) são conhecidos como parâmetros cinéticos, Tal equação é dada pela fórmula:

Vi=Vmáx [s]Km + [s]

A constante Km indica a afinidade entre a enzima e o substrato, onde km representa a concentração de substrato necessário para saturar metade da quantidade de enzima. O parâmetro Vmáx é a velocidade máxima que a reação pode alcançar, isto é, a situação limite em que todas as enzimas se encontram “ocupadas” pelo substrato, pode-se observar a representação de Km e Vmáx figura 1 [4].

Figura 1 - (a) representação de Km (b) representação Vmáx

Imagem adaptada de LEHNINGER (2014)

Vários tipos de reações podem ser catalisadas por enzimas, e as reações que catalisam, podem ser classificadas em: oxirredutases (catalisam reações de oxidação e redução); transferases (catalisam transferência de átomos ou grupos de átomos); hidrolases(catalisam reações de hidrólise); liases (catalisam reações aonde sai uma molécula que não é a água); isomerases (catalisam a transformação de um isômero no outro), ligases (catalisam reações em que há síntese de moléculas) [1]

A sacarose é um dissacarídeo não redutor que possuir uma função energética para o corpo . A enzima invertase é uma enzima de grande importância industrial, conhecida pela catálise da reação de hidrólise da ligação glicosídica da sacarose que ao ser hidrolisada é obtido frutose (β -D- frutose) e glicose (α -D-glicose). A velocidade desta reação pode ser determinada através da variação da quantidade de sacarose e de frutose ou glucose, ou pela variação rotação óptica da sacarose [5].

Frutose e a glicose são açucares redutores, ou seja, possuem o seu grupo carbonílico e livre, e na presença de agentes oxidantes e em sua forma linear são oxidados a um grupo carboxílico [5].

Inicialmente desenvolvido para detecção de açúcares em urinas de diabéticos em 1921, o método do ácido 3,5-dinitrosalicilico (DNS) ainda é muito utilizado no século XXI na indústria alimentícia para realizar o porcentual teórico de etanol presente nos destilados, onde a glicose e a frutose se destacam na produção de vinho, cachaça e etanol [5].

O DNS é um composto amarelado e pode sofrer redução pelos açúcares redutores para um composto nitroamino análogo, 3-amino-5-nitrosalicilico, ao mesmo tempo que os açucares são oxidados, tendo com característica uma coloração avermelhada e quanto mais intensa a cor maior será a quantidade de açúcares redutores [5].

Objetivos

O presente relatório visa mostrar os resultados obtidos experimentalmente e como atua a cinética enzimática utilizando como exemplo a invertase, onde será avaliado a atividade através da formação de produtos, no caso açucares redutores e será verificado os efeitos de alguns parâmetros, como: concentração da enzima, tempo de incubação, variação do pH e concentração de substrato. Através da concentração de