Visita De Estudo à Lusofona

Introdução

A experiência do DNA fingerprinting teve como objetivo a familiarização com o processo de hidrólise do ADN, de eletroforese em gel de agarose e a identificação de padrões de restrição do ADN.

Por sua vez, o objetivo da atividade da Clonagem de Genes foi cultivar e transformar culturas de bactérias de Escherichia coli com o plasmídeo pGlo®, bem como a análise das transformações anteriores realizadas nos diferentes meios de cultura utilizados.

Para a elaboração destas atividades experimentais serão necessários variados termos e conceitos abordados teoricamente na disciplina de Biologia, os quais serão explicados em seguida.

A Engenharia Genética permite a intervenção no genoma de um organismo, construindo novos genomas por recombinação de segmentos de DNA de um mesmo ou diferentes cromossomas. Assim, esta área permite conhecer melhor algumas doenças humanas, evoluir os métodos de agricultura relativamente a adubos e pesticidas e, oferece ainda produtos sedutores à indústria (como por exemplo, os transgénicos – organismos em que todas as células são portadoras de material genético estranho que lhe foi introduzido por técnicas de engenharia genética).

No século XX foi descoberta a estrutura da molécula de ADN, Ácido Desoxirribonucleico, a qual é composta por duas cadeis polinucleotídicas que se encontram “enroladas” helicoidalmente, ou seja, formando uma dupla hélice. O ADN é constituído por quatro tipos de nucleótidos, unidade básica do ADN (que por sua vez são constituídos por uma pentose, um grupo fosfato e uma base azotada).

Também neste século foi conseguido o isolamento das enzimas de restrição. As enzimas de restrição são proteínas (endonucleases de restrição), que existem nas bactérias e funcionam como o seu mecanismo de defesa contra os bacteriófagos. Estas enzimas são capazes de cindir a molécula de ADN em locais específicos, já que reconhecem pequenas sequências específicas de nucleótidos, catalizando, nesses locais, a destruição de uma ligação fosfodiéster entre dois nucleótidos consecutivos ligados a determinadas bases, isto é, fragmentam o ADN por hidrólise em locais específicos, as chamadas zonas de restrição. Por exemplo, a enzima Eco R1 reconhece a porção da hélice dupla: 5’GAATTC3’.

As extremidades do ADN, resultantes dessa fragmentação, podem denominar-se coesivas, se estas se ligarem facilmente, através da formação de pontes de hidrogénio, ou não coesivas, se a ligação entre estas for menos eficiente. As extremidades coesivas do ADN podem ligar-se, por complementaridade, a outro ADN por acção de outras enzimas denominadas ligases do DNA, que catalizam o processo que permite que os fragmentos de ADN se voltem a ligar.

A descoberta destes dois tipos de enzimas forneceu a oportunidade de manipular e transferir genes de uma molécula de ADN para outra, isto é, de um organismo para outro. Para que esta transferência possa ser realizada é necessária a existência de um “meio de transporte”, ou seja, de uma entidade que possa levar o material genético do genoma de onde foi retirado para para o genoma que o irá receber. Esta entidade é designada por vetor. Um dos vetores mais utilizados é o plasmídeo das bactérias, que é uma pequena molécula de ADN circular, que não é necessária à sobrevivência das bactérias e que possui uma capacidade de replicação autónoma. Alguns plasmídeos possuem genes que lhes conferem resistência a um antibiótico, o que permite localizar as bactérias que têm o ADN recombinante.

Uma das técnicas mais utilizadas em engenharia genética foi a técnica do ADN recombinante, que consiste na produção de moléculas de ADN a partir da combinação de genes com proveniências diferentes. Este ADN é o que resulta da introdução artificial, de uma sequência de ADN de um organismo no genoma de outro a partir da acção das enzimas de restrição, das ligases do ADN e dos vectores. Em suma, a técnica do DNA recombinante consiste em, utilizando as enzimas de restrição bacterianas, cortar duas moléculas diferentes de ADN do plasmídeo e, pela acção das ligases, unir os segmentos resultantes e formar um DNA recombinante. Esta técnica tem sido muito desenvolvida uma vez que possui variadas finalidades, como por exemplo a produção de insulina em seres procariontes.

Uma outra técnica utilizada nesta área é a do DNA complementar (cDNA), que utiliza também uma enzima existente em determinados vírus, que catalisa a formação de ADN a partir de RNA, que é a enzima transcriptase reversa. Esta técnica é utilizada quando se pretende clonar genes sem os seus intrões, visto que o ADN obtido (cDNA) é produzido a partir de uma molécula de mRNA maturado e que por isso já se encontra numa forma funcional. Após a formação da primeira cadeia de cDNA, a DNA polimerase permite a formação da cadeia complementar, constituindo-se uma molécula estável.

A diferença entre o cDNA e o ADN original é que a primeira não possui intrões, o que permite a localização das regiões codificantes, os exões, e as não codificantes, os intrões, de um determinado gene. Esta técnica em conjunto com a clonagem de genes torna mais fácil a produção de proteínas de seres eucariontes em seres procariontes (bactérias), como é o caso da insulina. Estas proteínas podem ainda ser produzidas em grandes quantidades já que quando os hospedeiros se dividem multiplicam também as moléculas de DNA neles introduzidas, originando um grande número de cópias (ou clones).

Uma das questões que se coloca quando se pretende utilizar, nestas técnicas, genes de indivíduos é a quantidade de ADN que é necessária para estes procedimentos. A técnica do PCR (reações de polimerização em cadeia) permite ultrapassar este problema. Nesta técnica aquece-se o ADN com o objectivo de o separar em duas cadeias, em seguida adiciona-se um oliglonucleótido , designado primer, este é sintetizado de modo a ser complementar às extremidades 3’ do segmento de ADN a amplificar, flanqueando-o. Adicionam-se, também, nucleótidos e uma enzima DNA polimerase para que a dupla hélice se reponha a partir de cada uma das cadeias simples formadas. Repete-se este procedimento até se obterem cópias suficientes do ADN em estudo.

Em 1964, foi desenvolvida uma técnica que permite identificar porções de ADN, designada DNA fingerprint ou impressões digitais genéticas. No seio do DNA encontram-se zonas de restrição. Estas zonas variam em número e em tamanho, de indivíduo para indivíduo. Este facto pode ser utili¬zado de diversos modos para identificar geneticamente os indivíduos, a partir de uma pequena amostra de material biológico que contenha material genético, como por exemplo leucócitos,