Reprodutível Princípio do Método

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• Princípio do método

Esperma intacto, não fixado (amostras frescas, congeladas / não diluídas, diluídas) é imerso em um microgel de agarose inerte em uma lâmina pré-tratada. Um tratamento ácido inicial desnatura o DNA dos espermatozóides com DNA fragmentado. Depois disso, a solução de lise remove a maioria das proteínas nucleares, quando a ausência de DNA maciço a ruptura está presente, os nucleotídeos do esperma com DNA fragmentado, não mostram um halo de dispersão ou o halo é mínimo.

• Descrição dos reagentes

Todo kit contém o necessário para realizar 10 ensaios. Os componentes são:

• Agarose Cel Support (ACS); 1 unidade
• Lâminas revestidas (SCS); 10 unidades
• Tubos Eppendorfs (ETP); 10 unidades
• Solução 1 (DA) agente desnaturante, de 10 ml
• Solução 2 (LS) de lise de 10 ml
• Solução 3 (SSA) coloração A de eosina de 10 ml
• Solução 4 (SSB) coloração B de tiazina de 10 ml
• Flutuador

• Material e equipamento necessários não fornecidos com o kit

Microscópio de campo ou de fluorescência, refrigerador a 4º C, banho (s) de incubação a 37º C e 95-100º C, plástico luvas, lamínulas de vidro (24 x 24 mm). Micropipetas, placas de Petri ou bandeja similar, pipetas descartáveis, água destilada, etanol a 70% e 100%. Forno de microondas e exaustor.

• Amostra de esperma

As amostras de sêmen fresco devem ser coletadas em um recipiente estéril. O ensaio de fragmentação do DNA do esperma deve seja realizada imediatamente após a amostra de esperma ter sido obtida ou descongelada após a criopreservação.

• Instruções de uso

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1. Coloque o tubo de parafuso de agarose (ACS) no flutuador e derreta usando um banho de água (ou um copo com água em uma placa quente) a 95-100 ° C durante 5 minutos ou até que esteja totalmente derretida. Caso contrário, se você preferir derreter a agarose usando um forno de microondas, encha 100 ml de água em um copo. Em seguida, coloque o ACS ligeiramente aberto com o flutuador dentro do copo e aqueça a potência máxima durante 1,5 minutos. Assista constantemente e pare o processo assim que a água começa a ferver. Por favor, não deixe a ACS ferver dentro do microondas! Aliquote 10 tubos eppendorf (ET) com 100 microlitros de agarose fundidos. Imediatamente depois, mantenha o Eppendorf a ser utilizado a 37ºC por 5 minutos para evitar a gelificação.

Os restantes tubos Eppendorf que não serão utilizados naquele momento serão armazenamento na geladeira junto com o kit.

Configure as Soluções 1 e 2 à temperatura ambiente (22 ° C) durante todo o processo.

Prepare e selecione as lâminas (SCS) que serão usados.

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2.. Diluir a amostra de esperma em um extensor de esperma humano adequado ou PBS para um máximo de 20 milhões de espermatozóides por mililitro.

 3. Imediatamente depois, transfira 50 ml da amostra de esperma para o tubo Eppendorf e misture suavemente com uma micropipeta. A formação de bolhas deve ser evitada.[pic 4]

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 4. Em seguida, coloque uma gota de 8 µl da suspensão celular no centro do poço da amostra ("S"). Tampe com uma lamínula. Pressione suavemente, evitando a formação de bolhas de ar. Os slides devem ser mantidos em posição horizontal durante todo o processo. Use o poço "C" para processar um controle amostra.

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5. Coloque a lâmina sobre uma superfície fria (por exemplo, uma placa de metal ou de vidro previamente resfriada a 4 ° C) e transferira para a geladeira a 4 ° C, durante 5 minutos para solidificar a agarose.

 6. Retire a lâmina da geladeira e remova a lamínula deslizando-a gentilmente. Todos os processos devem ser realizado a temperatura ambiente (22 ºC)[pic 7]

7. Coloque a lâmina horizontalmente em uma posição elevada como sugerido na figura em uma placa de Petri[pic 8]

ou bandeja semelhante. Aplique a Solução 1 (DA) no poço certificando-se de que está totalmente coberto pelo reativo durante a todo o processo. Incubar durante 7 minutos. Em seguida, remova o reativo inclinando até completar a secagem e coloque a lâmina horizontalmente em uma posição elevada como sugerido na figura. É muito importante remover o reativo sem agitar. Realizar a remoção inclinando-se e deixando-o deslizar.

8. Aplique a solução 2 (LS) no poço, certificando-se de que está totalmente imerso. Incube por 20 minutos. Em seguida, remova o reativo inclinando-se até completar a secagem e coloque a lâmina horizontalmente em uma posição elevada como sugerido na figura. É muito importante remover o reativo sem tremer. Realizar a remoção inclinando e deixando deslizar.[pic 9]

 9. Lave a lâmina por 5 min cobrindo com água destilada e usando uma pipeta descartável. Em seguida, remova o reativo inclinando-se até completar a secagem e coloque a lâmina horizontalmente em uma posição elevada como sugerido na figura. Desidratar por inundações com 70% de etanol, usando uma pipeta descartável e incubar durante 2 minutos. Drene e aplique 100% de etanol por 2 minutos. Escorra e deixe secar horizontalmente em papel de filtro ou similar. Após a secagem, as lâminas processadas podem ser mantidas em caixas deslizantes à temperatura ambiente em um lugar seco e escuro por vários meses.[pic 10]