FOSFOMONOESTERASES – FOSFATASES ÁCIDA E ALCALINA

FOSFOMONOESTERASES – FOSFATASES ÁCIDA E ALCALINA

Metodologia: (TABATABAI, M. A.; BREMNER, J. M. Use of ρ-nitrofenol phosphate for assay of soil phosphatase activity. Soil Biology & Biochemistry, Oxford, v. 1, p. 301-307, 1969).

Reagentes:

- Solução estoque do tampão universal modificado (MUB): dissolver 12,1 g de Tris (hidroximetil) aminometano (THAM); 11,6 g de ácido maléico; 14,0 g de ácido cítrico e 6,3 g de ácido bórico (H3BO3) em 488 mL de hidróxido de sódio 1 N (NaOH 1 N = 40 g de NaOH em 1 L de água destilada), complete a solução para volume final de 1 L com água destilada. Armazene sobre refrigeração.

- Tampão universal modificado:

        - pH 6.5 (fosfatase ácida): 200 mL da solução estoque de MUB, ajuste o pH para 6.5 com ácido clorídrico (HCl) 0.1 M e complete a solução para volume final de 1 L de água destilada.

        - pH 11.0 (fosfatase alcalina): 200 mL da solução estoque de MUB, ajuste o pH para 11.0 com hidróxido de sódio (NaOH) 0.1 M e complete a solução a 1 L com água destilada.

- Solução de ρ-nitrofenil fosfato de sódio 0.05 M: dissolver 0,840 g de ρ-nitrofenil fosfato de sódio tetrahidratado em 50 mL com o tampão MUB de mesmo pH. FAZER A SOLUÇÃO NO DIA E MANTER SOBRE REFRIGERAÇÃO.

- Cloreto de cálcio (CaCl2) 0.5 M: dissolva 73,5 g de CaCl2.2H2O em 1 L com água destilada.

- Hidróxido de sódio (NaOH) 0.5 M: dissolva 20 g de NaOH em 1 L com água destilada.

- Solução padrão de ρ-nitrofenol para a curva de calibração: dissolva 1,0 g de ρ-nitrofenol em 1 L com água destilada. Mantenha a solução sobre refrigeração.

Procedimentos:

- Pesar 1,0 g de solo em tubos de ensaio (duplicata das amostras + branco por amostra).

- Adicional 4 mL do tampão MUB modificado.

- Adicionar 1 mL da solução de ρ-nitrofenil fosfato de sódio nas amostras.

- Agitar os frascos para misturar os conteúdos. Fechar e incubá-los a 37º C por 1 hora.

- Adicionar 1 mL de CaCl2 0.5 M e 4 mL de NaOH 0.5 M, misturado vigorosamente.

- Filtrar a suspensão do solo em papel filtro Whatman nº.2.

- Medir a intensidade da cor amarela do filtrado em espectrofotômetro em 420 nm.

-Controles deverão ser desenvolvidos para cada amostra de solo analisado para detecção da cor não proveniente do ρ-nitrofenol liberado pela atividade da fosfatase. Para desenvolver os controles, seguir o procedimento descrito para a determinação, mas realizar a adição de 1 mL da solução de ρ-nitrofenil fosfato de sódio somente após a adição de 1 mL de CaCl2 0.5 M e 4 mL de NaOH 0.5 M.

Curva de calibração:

- Calcular o conteúdo de ρ-nitrofenol presente no filtrado utilizando como referência o gráfico de calibração, montado a partir dos resultados obtidos com padrões contendo 0, 10, 20, 30, 40 e 50, 60, 80, 90, 100, 120, 150, 200, 250, 270, 300 μg de ρ-nitrofenol/frasco.

- Diluir 1 mL da solução padrão de ρ-nitrofenol para volume final de 100 mL com água destilada em frascos volumétricos e misturar vigorosamente;

- Pipetar alíquotas de 0-, 1-, 2-, 3-, 4-, e 5-mL da solução padrão diluída em tubos de ensaio e ajuste para volume final de 5mL com água destilada;