A Imunofluorescência direta e indireta

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FIBRA- Faculdade do Instituto Brasil

Instituto Brasil de Ciências e Tecnologia Ltda. – I.B.C.T.

Kamilla Nadia

Priscila Rodrigues Ferreira Pires

Imunofluorescência direta e indireta

Trabalho para obtenção de parte

da nota de 1° verificação de

aprendizagem da disciplina de

Imunologia Clinica do Prof:

Adelsom Bezerra de Souza.  

Anápolis 07 de Março de 2017

INTRODUÇÃO

As reações imunológicas que envolvem a ligação antígeno-anticorpo podem ser visualizadas ou quantificadas por meio de diferentes marcadores para o antígeno ou para o anticorpo. Entre os marcadores mais comumente empregados, podem-se citar os fluorocromos, as enzimas e os compostos radioativos e eletro-opacos. Os primórdios da imunofluorescência direta (IFD) datam de 1942, quando Albert Coons e col. demonstraram a marcação de anticorpos antipneumococos com fluoresceína no tecido pulmonar. Os fluorocromos são corantes que absorvem radiação (luz ultravioleta), são por ela excitados e emitem luz visível. Para que funcionem como marcadores, necessita possuir grupos químicos capazes de formar ligações covalentes com moléculas protéicas, emitindo alta fluorescência no espectro visível com coloração distinta da emitida pelos tecidos. Devem ter uma conjugação relativamente simples, retenção da atividade do anticorpo na proteína marcada e estabilidade do conjugado fluorescente obtido. Um dos fluorocromos mais utilizados é o isotiocianato de fluoresceína (FITC), de cor verde, que tem um pico de absorção de 490l e de emissão de 520l. A rodamina, outro agente utilizado na IFD, de cor vermelha, possui picos distintos de absorção e de emissão (520l e 610l). O microscópio utilizado para a leitura de IFD pode ser de epiluminescência ou confocal. Na leitura das reações de imunofluorescência (IF), devem-se enumerar três formas distintas de fluorescência: específica, não específica e autofluorescência. A fluorescência específica deve-se à reação entre o substrato e a proteína marcada com o fluorocromo (reação antígeno-anticorpo). A fluorescência não específica deve-se à coloração dos tecidos por corante livre ou proteínas fluoresceinadas, ou ambos. A autofluorescência ocorre devido à fluorescência natural dos tecidos (amarela, azul), quando expostos à luz ultravioleta. A imunofluorescência foi introduzida na Dermatologia na década de 60, quando Beutner e Jordon, por meio dessa técnica, revelaram anticorpos tanto no tecido como circulantes nas dermatoses vesicobolhosas autoimunes, especialmente, nos pênfigos vulgar (PV) e foliáceo (PF)4-5 e penfigoide bolhoso (PB). Atualmente, os estudos de imunofluorescência são determinantes no diagnóstico laboratorial das dermatoses bolhosas autoimunes, mas também desempenham importante papel na investigação de outras enfermidades, como: dermatoses inflamatórias (lúpus eritematoso, líquen plano, porfírias, vasculites).

IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA

O melhor local e o tempo de evolução das lesões cutâneas para realizar biópsia para o exame de imunofluorescência direta (IFD) dependem da enfermidade em investigação. Em termos gerais, a biópsia deve ter uma extensão adequada (punch 4mm), bem como uma profundidade que represente epiderme e derme suficientes. Além disso, quanto menor for o traumatismo realizado durante o procedimento, melhor será a amostra para análise. O papel principal da utilização da imunofluorescência direta é identificar anticorpos e outras proteínas inflamatórias na região lesada por alguma doença e assim confirmar ou excluir a suspeita clínica diagnóstica de lesão de etiologia ligada a distúrbios da imunidade humoral23. É de se supor, portanto, que uma doença que apresente fluorescência positiva na mucosa para imunoglobulinas esteja condicionada a distúrbios na produção de anticorpos e seja de natureza auto-imune, como acontece. Por conseguinte, a IfD é um ótimo exame para fazer diagnóstico diferencial entre doenças auto-imunes e entre aquelas que não têm relação com alterações da imunidade humoral. Em contrapartida, é bom lembrar que fluorescência negativa não é um dado patognomônico de doença ligada a distúrbios da imunidade celular.

Para que serve

Sendo um método de identificação de antígenos é extremamente importante para a complementação diagnóstica das lesões bolhosas autoimunes. Nos pênfigos vulgar, foliáceo e suas variantes como o  fogo selvagem essa técnica possibilita demonstrar os auto-anticorpos contra o  epitélio que se depositam nos espaços intercelulares da epiderme. A IFD é também importante na avaliação diagnóstica das dermatoses bolhosas  subepidérmicas autoimunes, como o penfigóide bolhoso, herpes gestacional, dermatite herpetiforme, dermatose por IgA linear, lúpus eritematoso bolhoso e  dermatose bolhosa adquirida. A IFO é também importante na confirmação diagnóstica de colagenoses, em particular o lúpus eritematoso, e vasculites.

IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA

 A imunofluorescência indireta (IFI) apresenta um importante auxílio diagnóstico nas dermatoses vesicobolhosas autoimunes (DVB), como também permite a avaliação de auto-anticorpos circulantes, sendo, muitas vezes, possível a correlação clínico-laboratorial dos doentes. A técnica de IFI aplicada a estudos de anticorpos circulantes nas DVBs utiliza como substrato o epitélio normal. Os substratos variam de acordo com os protocolos de cada laboratório, mas, em nosso meio, a pele normal humana obtida de prepúcio, mama ou pálpebra é considerada ideal (fácil obtenção, boa antigenicidade), substituindo o esôfago de macaco.