A Validação de procedimentos analíticos

Parte 1

1.0. Validação de procedimentos analíticos

É necessário entender os parâmetros de que validam os métodos analíticos para seguir corretamente o desenvolvimento de um procedimento analítico.

A validação de um procedimento analítico é necessária para demonstrar que tal é adequado para finalidade pretendida.

Para validação de procedimentos analíticos, os tipos mais comuns são:

• Testes de identificação: são destinados a fim de assegurar a identidade de um analíto numa amostra. Isto é normalmente conseguido por comparação de uma propriedade da amostra com a de um padrão de referência;

• Testes para o conteúdo de impurezas: podem ser tanto um teste quantitativo ou um teste de limite para a impureza numa amostra. Este teste destina-se a verificar com precisão as características de pureza da amostra. São necessárias características diferentes de validação para um teste quantitativo do que para um teste de limite.

O objetivo do procedimento analítico deve ser claramente entendido visto que governará as características de validação que precisam ser avaliadas. Os parâmetros necessários são:

1. Seletividade e especificidade
2. Sensibilidade do método
3. Exatidão
4. Precisão
5. Limite de detecção
6. Limite de quantificação
7. Linearidade do método

1.1. Especificidade e seletividade

A especificidade é a capacidade do método analítico em detectar o analíto de interesse na presença de outros componentes da matriz. Para identificar o analíto é necessário comprovar a capacidade de seleção do método entre compostos com estruturas relacionadas que podem estar presentes.

A especificidade e a seletividade estão relacionadas com o evento da detecção. A especificidade refere-se a um método específico para apenas um analíto e a seletividade refere-se a um método utilizado para vários analítos com capacidade de distinção entre eles.

Em HPLC estes parâmetros são avaliados geralmente através da capacidade de resolução cromatográfica, da eficiência da separação e do fator de assimetria.

1.2. Sensibilidade

Sensibilidade é um parâmetro que demonstra a variação da resposta em função da concentração do analíto. Pode ser expressa pela inclinação da curva de regressão linear de calibração, e é determinada simultaneamente aos testes de linearidade. A sensibilidade depende da natureza do analíto e da técnica de detecção utilizada.

1.3. Exatidão

A exatidão de um método analítico traduz a proximidade do valor obtido em relação ao valor esperado, estipulado ou verdadeiro. Um método diz-se exato se o erro sistemático é inferior ao intervalo de confiança estimado e deve ser determinada após o estabelecimento da linearidade, do intervalo linear e da especificidade do mesmo.

Os procedimentos normalmente utilizados para avaliar a exatidão de um método são, dentre outros: uso de materiais de referência, participação em comparações interlaboratoriais e realização de ensaios de recuperação.

Os materiais de referência certificados são utilizados no processo de validação de um método de ensaio para avaliar o desempenho do laboratório, por isso o fornecimento de materiais de referência certificados (MRC) é realizado por organismos reconhecidos e confiáveis, como por exemplo o NIST. Na avaliação da exatidão utilizando um material de referência, os valores médios obtidos pelo laboratório e o desvio padrão de uma série de ensaios em duplicado, devem ser comparados com os valores certificados do material de referência, para esta comparação podem ser utilizados:

• Erro absoluto

• Erro relativo (ER);

• Erro normalizado;

• Testes de recuperação

A exatidão do método deve ser determinada após o estabelecimento da linearidade, do intervalo linear e da especificidade do mesmo, sendo verificada a partir de, no mínimo, 9 (nove) determinações contemplando o intervalo linear do procedimento, ou seja, 3 (três) concentrações, baixa, média e alta, com 3 (três) réplicas cada. A exatidão é expressa pela relação entre a concentração média determinada experimentalmente e a concentração teórica correspondente:

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1.4. Precisão

A precisão é a avaliação da proximidade dos resultados obtidos de varias medidas de uma mesma amostra, onde as formas mais comuns de expressá-la são por meio de repetibilidade, precisão intermédia e reprodutibilidade. A precisão é geralmente expressa como desvio padrão ou desvio padrão relativa.

A repetibilidade é o grau de concordância entre os resultados de medições sucessivas, efetuadas sob as mesmas condições, avaliando as diferenças aleatórias esperadas para a comparação dos mesmos resultados entre laboratórios distintos. A reprodutibilidade procura a verificação do desempenho dos seus métodos em relação aos dados de validação obtidos através de comparação interlaboratorial. A partir do desvio padrão obtido sob condições de reprodutibilidade é possível calcular o limite de reprodutibilidade “R”, o qual permite ao analista decidir se a diferença entre os valores da cópia das amostras analisadas sob condições de reprodutibilidade é significante.

Precisão intermédia refere-se à concordância entre os resultados do mesmo laboratório, mas obtidos em dias diferentes, com analistas diferentes e/ou equipamentos diferentes.

O método é considerado preciso quando apresentar níveis de variações dentro de um intervalo aceitável para cada nível de concentração.

1.5. Limite de Detecção

Limite de detecção é a menor quantidade do analíto presente em uma amostra que pode ser detectado. Este limite de detecção é estabelecido por meio da análise de soluções de concentrações conhecidas e decrescentes do analíto, até a menor quantidade que pode ser detectável pelo método.

Em métodos não instrumentais, esta determinação pode ser feita a olho nu, onde o limite de detecção é o menor valor de concentração capaz de produzir uma mudança de cor, turvação, entre outros.

1.6. Limite de Quantificação

É a menor quantidade do analíto em uma amostra que pode ser determinada com precisão e exatidão sob as condições experimentais estabelecidas. O limite de quantificação é um parâmetro determinado para ensaios quantitativos de impurezas e produtos de degradação, tal é expresso como concentração do analito (por exemplo, porcentagem p/p ou p/V, partes por milhão) na amostra.