Pratica extração de DNA

Aula prática II: ANÁLISE DE DNA ou RNA POR FRACIONAMENTO ATRAVÉS DE ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

Objetivo: Separar os fragmentos de DNA (ou RNA) de acordo com sseu peso molecular, através de sua migração através de uma matriz (gel) quando submetidos a um campo elétrico.

Preparo do Gel de agarose 0,8 %

1. Pesar 0,4 g de agarose, adicionar 50 mL tampão 0,5 X TBE pH 8,0 (0,089 M Tris-borato; 0,089 M ácido bórico; 0,002 M EDTA).

2. Aquecer e misturar até completa dissolução da agarose. Resfriar até temperatura de aproximadamente 40ºC (até conseguir segurar confortavelmente com as mãos). Adicionar Brometo de etídio (EtBr) para um aocncetração final de 0,5 μg/mL a partir da solução estoque (1 mg/mL).

Despejar sobre a placa de vidro (acrílico) devidamente emoldurada e vedada com fita crepe (quando necessário), tomando cuidado para não deslocar o pente previamente acertado. Deixar solidificar bem (pelo menos 15 min.) antes de retirar o pente. CUIDADO: EtBr é carcinogênico! Usar luvas.

3. Retirar o pente (cuidadosamente) e a fita crepe. Transferir a placa com o gel para a cuba de eletroforese.

4. Adicionar tampão TBE 0,5X à cuba de modo a cobrir o gel. Lembre-se: quanto menor for a camada de líquido sobre o gel, mais rápida será a corrida, portanto o tampão deve apenas cobrir o gel.

5. Aplicar as amostras (10 μl) previamente preparadas da seguinte maneira:

-9 μl de DNA (1 μg) dissolvido em tampão TE e 1 μl de Tampão de Amostra (glicerol 50% + corante (azul de bromofeno l + xilenocianol + 5mM EDTA)).

6. Ligar a fonte de eletroforese usando voltagem constante de 50-70V. Interromper a corrida quando o azul de bromofenol estiver a l cm do fim do gel (cerca de l h.).

Obs.: opcionalmente a EtBr pode não ser adicionado no gel. Assim, deve-se transferir o gel para uma placa de Petri, cobrir com o tampão usado na corrida (X 20 ml) e acrescentar a quantidade de brometo de etídio para a concentração final de 0,5 μg/mL. Corar por 15-30 min. Remover a solução contendo EtBr, transferindo-a CUIDADOSAMENTE para o recipiente especial de descarte. Acrescentar tampão de corrida para remover o excesso de EtBr

7. Observar o gel sob luz ultra-violeta em transiluminador.

9. Anotar os resultados comparando com os padrões marcadores de peso molecular (DNA de fago λ digerido com Hind III que dá pelo menos 6 fragmentos bem visíveis de 23; 10; 7; 4; 2,2 e 2 Kpb) ou marcador Ladder 100.

Utilidades: muitas. Para citar alguns exemplos:

- fazer a análise de preparações de DNA genômico ou plasmideal - pelo padrão de bandas e presença de contaminantes espúrios, é possível fazer uma avaliação da qualidade e da quantidade do material.

- determinar tamanho de fragmentos de DNA (para fragmentos de RNA ou de DNA que são muito pequenos, utiliza-se géis de acüamida ao invés de agarose).

- obter diagnósticos de restrição (comparação do obtido com o padrão esperado permite certificar uma preparação).

- mapeamento físico (identificação dos sítios de restrição e suas posições relativas no fragmento de DNA ou no DNA plasmideal).

- separar (DNA ou RNA) no gel para depois transferir para membranas de nylon ou nitrocelulose, para detectar e/ou quantificar determinados genes ou transcritos.

- detectar e quantificar amplificação de moléculas de DNA, obtida por reação de poümerase em cadeia (PCR).

Fatores que influenciam a migração em gel de agarose:

Concentração

Tamanho dos fragmentos de DNA: fitas lineares duplas passam através da matriz do gel a uma velocidade inversamente proporcional ao log pb (fragmento menor é mais rápido).

Conformação do DNA: o formato do fragmento de DNA de um determinado tamanho influencia a velocidade de migração (circular fechado: + rápido; circular aberto: mais lento; linear: intermediário).