QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DO BIURETO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE - FURG[pic 1][pic 2]

ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS - EQA

BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL

Prática 2:

QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO DO BIURETO

Júlia Gonzalez - 86756

Lisliane Kickofel - 71591

Simone Soares - 47475

Profª.: Márcia Luvielmo

Rio Grande

 2018

1. INTRODUÇÃO

As proteínas são as biomoléculas mais abundantes nos seres vivos, estando presentes em todas as partes de uma célula, possuindo uma diversidade de funções biológicas. São polímeros, cujas unidades constituintes fundamentais são os aminoácidos, sendo constituída de uma ou mais cadeias lineares desses aminoácidos, chamado de polipeptídeo, sua estrutura pode ser vista na Figura 1.1, é possível observar sua estrutura básica que consiste em um átomo de carbono central, conhecido como carbono alfa , ligado a um grupo amina (NH2), um grupo carboxila (COOH), um átomo de hidrogênio e a cadeia lateral “R” que difere os aminoácidos em sua estrutura, tamanho, cargas elétricas, solubilidade em água, resumindo o comportamento químico (FRANCISCO JR, W. E.; FRANCISCO, Welington, 2016; KHAN ACADEMY)[pic 3]

[pic 4]

Figura 1.1. Molécula de aminoácido

Cada proteína consiste de uma ou mais cadeias de polipeptídeos, onde cada uma dessas cadeias é formada por aminoácidos ligados por uma forma específica. Os aminoácidos de um polipeptídeo são ligados a seus vizinhos por ligações covalentes conhecidas por ligações peptídicas. Cada ligação é formada em uma reação de síntese de desidratação (condensação). Durante a síntese proteica, o grupo carboxila do aminoácido do final da cadeia crescente de polipeptídeos reage com o grupo amina do aminoácido que está entrando, liberando uma molécula de água, sendo a ligação resultante uma ligação peptídica, podendo ser observada na Figura 1.2, a seguir (KHAN ACADEMY).

[pic 5]

Figura 1.2. Ligação peptídica

        

        Existem vários métodos para a determinação de proteínas totais, que foram desenvolvidos para diferentes amostras, como células bacterianas (método de Biureto), proteínas dissolvidas (Bradford), soluções que contenham detergentes (BCA – Ácido Bicinconínico), proteína pura (absorção UV), alimentos (Biureto, Lowry, Bradford), plasma sanguíneo (Biureto, Lowry, Bradford), plantas (Lowry), entre outras. Cada método apresenta um princípio diferente e precisa ser analisado separadamente (MIWA et al. 2008).

        As origens do método de biureto podem ser traçadas desde a proposta inicial de Autenrieth, em 1915, após houve modificações, sendo, atualmente a proposta metodológica de Gornall et al. a mais utilizada (ZAIA et al. 1998). O Biureto é um composto orgânico, formado durante a produção da uréia, em solução de sulfato de cobre resulta em uma solução violeta. (FERREIRA et al. 2007).

[pic 6]

Figura 1.3. Reação de formação do biureto.

O método de Biureto envolve a mistura de sulfato de cobre e hidróxido de sódio com tartarato de sódio, que estabiliza o cobre em solução, ocorrendo a formação de um complexo planar do cobre com a ligação peptídica da proteína, em meio alcalino. O produto da reação apresenta duas bandas de absorção, uma em 270 nm e outra em 540 nm. Apesar da banda de 270 nm aumentar em seis vezes a sensibilidade do método de biureto, a banda de 540 nm é a mais utilizada, devido a diversas substâncias, normalmente presentes na maioria dos meios analisados, absorverem em 270 nm, causando muita interferência no método (MIWA et al. 2008; ZAIA et al. 1998).

[pic 7]

Figura 1.4. Complexo entre Cu2+ e a proteína (ligação peptídica)

        É um método bastante aplicado para determinar a concentração de proteínas totais em diversos meios, sendo eles: soro ou plasma sanguíneo, alimentos, urina, saliva, entre outros. Uma das grandes desvantagens desse método é por ele não ser sensível e também está sujeito a interferência de substâncias que possam reagir com os íons cobre (ZAIA et al. 1998).

1. OBJETIVO

Esse experimento possui o objetivo de correlacionar a concentração protéica e a absorção de energia em espectrofotômetro UV-Vis, além de avaliar o conteúdo protéico em diferentes soluções.

1. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Materiais

• HCl;
• NaCl;
• NaOH 1 M;
• Solução padrão de albumina 5 mg mL-1;
• Solução aquosa de tirosina 4,5 mg mL-1;
• Amostra: clara de ovo;
• Balança analítica;
• Pêra de sucção;
• Pipeta de 5 mL;
• Pipeta de 1 mL;
• Tubos de ensaio;
• Béqueres de 50 mL;
• Espectrofotômetro de UV-Vis de feixe duplo;
• Banho-maria (37 °C);
• Balão volumétrica de 100 mL;
• Espátula;
• Reagente de biureto, preparado com:

• A: 3 g de sulfato de cobre;
• B: 9 g de tartarato de sódio e potássio;
• Dissolver A e B em 500 mL de uma solução de hidróxido de sódio 0,2 M.

3.2. Métodos

3.2.1. Curva padrão da glicose

        Enumerou-se 5 tubos e procedeu-se conforme a Tabela 3.2.1. Realizou-se duplicata para cada tubo.

        

Tubo	Solução de albumina (mL)	Água (mL)	NaOH (mL)	Reativo de Biureto (mL)	Banho a 37 °C (min)
1 (branco)	0	2	0,5	3	10
2	0,5	1,5	0,5	3	10
3	1	1	0,5	3	10
4	1,5	0,5	0,5	3	10
5	2	0	0,5	3	10

Tabela 3.2.1. Procedimento para a execução da curva padrão de albumina

Realizou-se a varredura na faixa de 540 nm.

3.2.2. Efeito do solvente

        Enumerou-se 8 tubos e procedeu-se conforme a Tabela 3.2.2.