Espectrofotometria

1. INTRODUÇÃO TEÓRICA

1.1- Espectrofotometria

O conhecimento da absorção de luz pela matéria é a forma mais usual de

determinar a concentração de compostos presentes em solução. A maioria dos métodos

utilizados em bioquímica clínica envolve a determinação espectrofotométrica de compostos

corados (cromóforo) obtidos pela reação entre o composto a ser analisado e o reagente

(reagente cromogênico), originando um produto colorido. Os métodos que se baseiam

nesse princípio são denominados métodos colorimétricos, os quais geralmente são

específicos e muito sensíveis. A grande vantagem em utilizar compostos coloridos deve-se

ao fato de eles absorverem luz visível (região visível do espectro eletromagnético).

A espectrofotometria — medida de absorção ou transmissão de luz — é uma das mais

valiosas técnicas analíticas amplamente utilizadas em laboratórios de área básica, bem

como em análises clínicas. Por meio da espectrofotometria, componentes desconhecidos

de uma solução podem ser identificados por seus espectros característicos ao ultravioleta,

visível, ou infravermelho.

Quando um feixe de luz monocromática atravessa uma solução com moléculas

absorventes, parte da luz é absorvida pela solução e o restante é transmitido. A absorção

de luz depende basicamente da concentração das moléculas absorventes e da espessura

da solução – caminho óptico (veja Figura 1).

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1.2- Componentes do espectrofotômetro

Alguns componentes são comuns a todos os espectrofotômetros, como é verificado

a seguir. A luz, habitualmente fornecida por uma lâmpada, é fracionada pelo prisma ou

rede de difração (monocromador) nos comprimentos de onda que a compõem (luzes

monocromáticas). O comprimento de onda selecionado é dirigido para a solução contida

em um recipiente transparente (cubeta). Parte da luz é absorvida e parte é transmitida.

A redução da intensidade luminosa é medida pelo detector (célula fotelétrica) porque o

sinal elétrico de saída do detector depende da intensidade da luz que incidiu sobre ele.

O sinal elétrico amplificado e visualizado no galvanômetro em números, é lido como

uma absorbância e é proporcional à concentração da substância absorvene existente na

cubeta.

Figura 2: Esquema óptico dos principais componentes do espectrofotômetro. As letras representam:

(a) fonte de luz, (b) colimador, (c) prisma ou rede de difração, (d) fenda seletora de X, (e) compartimento de

amostras com cubeta contendo solução, (f) célula fotelétrica, (g) amplificador.

1.3- Lei de LAMBERT-BEER

Quando um feixe de luz monocromática, atravessava um meio transparente

homogêneo, cada camada deste meio absorvia igual a fração de luz que atravessava,

independentemente da intensidade da luz que incidia. A partir desta conclusão foi

enunciada a seguinte lei:

" A intensidade da luz emitida decresce exponencialmente à medida que a espessura

do meio absorvente aumenta aritmeticamente ".

Esta lei foi descoberta pela primeira vez em 1729 pelo matemático, geofísico

e astrônomo francês Pierre Bouguer (1698-1758). Sua autoria é, contudo, frequentemente

atribuída de forma errada ao matemático, físico e astrônomo francês Johann

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Lambert (1728-1777). No seu trabalho em 1760, Lambert citou a descoberta de Bouguer

e constatou que a fração de luz que é absorvida por uma amostra é independente da

potência radiante incidente (Pλo). Este fato é conhecido como Lei de Lambert, embora, na

realidade, só seja verdadeira se Pλo for pequeno e se a extensão de outros fenômenos

como a dispersão da luz ou reações fotoquímicas for desprezável.

Só 92 anos depois é que a lei foi modificada de forma a incluir a concentração da

solução na fórmula de cálculo. Essa modificação foi da autoria do físico e matemático

alemão August Beer (1825-1863). Beer em 1852 observou a relação existente entre a

transmissão e a concentração do meio onde passa o feixe de luz. Uma certa solução

absorve a luz proporcionalmente à concentração molecular do soluto que nela encontra,

isto é, " A intensidade de um feixe de luz monocromático decresce exponencialmente à

medida que a concentração da substância absorvente aumenta aritmeticamente ".

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