As Diferenças entre imunofluorescência direta e indireta

1- Diferenças entre imunofluorescencia direta e indireta

Na direta, usada para identificar a presença de Ag, o fluorocromo já está ligado ao Ac (já conhecido) introduzido na lâmina. Se o conjugado (fluorocromo + Ac) for específico para o Ag ,haverá a ligação. A lâmina é lavada e após isso é possível ver os resultados no microscópio óptico propício.

Na indireta, usada para identicar a presença de determinados Ac, o Ag já está na lâmina também. Porém, é adicionado o soro do paciente em questão à lâmina. Faz-se a lavagem da lâmina para a retirada do excesso de Ac. Após isso, adiciona-se o conjugado, que é um Anti-Ac + fluorocromo. Lava-se a lâmina para retirada dos Ac ou anti-Ac que não se ligaram e depois é observada a lâmina ao M.O.

2- Quais são as vantagens da indireta sobre a direta

A indireta possui maior sensibilidade = a cada determinando antigênico liga-se uma molécula de Ac do soro, mas neste Ac podem-se ligar várias moléculas de Ac fluorescentes, permitindo a detecção de quantidades mínimas de Ac do paciente

E podem ser pesquisados Ac de diferentes especificidades com um mesmo conjugado, pois o Ac marcado com o fluorocromo tem especificidade para imunoglobulinas da espécie (p.ex., conjugado com Anti-IgM ou Anti-IgG)

4- O Elisa direto (copiei todos os ELISAs aqui)

 (1) Método competitivo – mais para identificação de Ag (tbm AC)

• Adsorve o anticorpo no poço da microplaca
• Adição de solução de antígeno ou anticorpo
• Adição do Ag ou Anti-Ac marcado com uma enzima
• Os poços sem Ag primário aderido ao Ac ficam coloridos, enquanto que os poços que possuem Ag primários aderidos aos Ac não mudam de cor.

(2) Método indireto - detecção de anticorpos[pic 1]

• Ag fica aderido aos poços da microplaca
• Adição do Ac problema
• Adição do Ac marcado com enzima (anti-Ac)
• A presença de cor nos poços indica a presença do anticorpo, e os poços que não mudarem de cor indica a ausência do anticorpo em questão.
  

(3) Método de sanduíche ou captura - identificação de antígenos[pic 2]

• O Ag fica entre dois anticorpos
• Ac primário específico ao Ag é adsorvido no poço da microplaca
• Ag na solução problema é adicionado
• Adição do segundo anticorpo específico marcado com uma enzima. Esta enzima que reage com o substrato fazendo com que o cromógeno mude de cor.
• A presença de cor nos poços indica a presença do antígeno, e os poços que não mudarem de cor indica a ausência do antígeno em questão

COR - A intensidade da cor é proporcional a quantidade de anticorpos ou antígenos presente no soro. A intensidade pode ser analisada por um espectrofotômetro (reação colorimétrica), permitindo uma análise quantitativa.

5- O que procura o Elisa indireto e o sanduiche

        Elisa Indireto = Detecção de Ac

        Elisa Sanduíche = Detecção de Ag

6- Descreva o western blot

        Permite identificar um antígeno numa mistura complexa de proteínas.

Combinação entre eletroforese em gel e detecção imunológica.

(1) Eletroforese, separando os antígenos por tamanho

(2) Transferência para uma membrana imobilizante (de nitrocelulose) com anticorpos específicos ligados a uma enzima reveladora, que causa mudança de cor ou sinal fotométrico.

• Teste confirmatório – envolve reconhecimento de antígenos isolados

[pic 3]

7- dx do HIV

        Diagnostico pelo western-blot. Duas ou mais bandas das seguintes: .,cada banda com reatividade maior ou igual ao padrão positivo.Utiliza antigenos do hiv de linhagem celular de cultura, separados pela eletroforese, transferidos para nitrocelulose. ocorre reação com anticorpo primario e secundario.Padrão positivo com visualização das bandas correspondes às proteinas virais p24, gp 41, gp 120

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