A Inovação Tecnológica em PCR

PCR em tempo real[pic 1][pic 2]

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         Uma Inovação tecnológica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)  

Caroline Monteiro Novais Estudante do curso de farmácia do Centro Universitário de Barra Mansa. E-mail: [e-mail]

Melissa  Pires-Alves

Doutora em Biologia Celular e Molecular pela Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Professora do Centro Universitário de Barra Mansa. E-mail: [e-mail]

Colaborador

Fábio  Freitas  Silva

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Introdução

advento da biologia molecular foi certamente um dos maiores passos das ciências biológicas durante[pic 4]

o Século XX. A descoberta da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) trou- xe enormes benefícios e desenvolvi- mentos científicos como o seqüenciamento de genomas, a ex- pressão de genes em sistemas recombinantes, o estudo de genética molecular, a determinação rápida da paternidade e o diagnóstico rápido de doenças infecciosas.

Ultimamente, uma inovação tecnológica resultante da PCR, deno- minada de PCR em Tempo Real, vem ganhando espaço nos diagnósticos clí- nicos e nos laboratórios de pesquisa por apresentar a capacidade de gerar resultados quantitativos. Essa técnica permite o acompanhamento da rea- ção e a apresentação dos resultados de forma mais precisa e rápida, em rela- ção à PCR que apresenta somente resultados qualitativos.

PCR

A Reação em Cadeia de Polimerase (PCR, do inglês Polymerase Chain Reaction), é uma metodologia que pode ser executada inteiramente in vitro sem o uso de células (BRUCE, 1999). A técnica da PCR foi desenvol- vida nos anos 80 por Kary Mullis, que recebeu, em 1994, o prêmio Nobel. A PCR possibilita a síntese de fragmentos de DNA, usando a enzima DNA-polimerase, a mesma que parti- cipa da replicação do material genéti- co nas células. Esta enzima sintetiza

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uma seqüência complementar de DNA, desde que um pequeno fragmento (o iniciador, ou primer, em inglês) já esteja ligado a uma das cadeias do DNA no ponto escolhido para o início da síntese. Os iniciadores definem a seqüência a ser replicada e o resultado obtido é a amplificação de uma deter- minada seqüência DNA com bilhões de cópias (MULLIS, 1990).

Utilização da técnica da PCR

O desenvolvimento da técnica de amplificação de segmentos de DNA utilizando a PCR abriu enormes pers- pectivas para a análise de genes, diag- nóstico de doenças genéticas e detecção de agentes infecciosos como citomegalovírus, vírus da hepatite B e C, herpes vírus simples, vírus da rubé- ola, vírus da imunodeficiência humana (HIV), Chlamydia trachomatis, Helicobater pylori, Mycobacterium tuberculosis e Pneumocistis  carinii. O avanço da ciência sobre a com- preensão dos genes trouxe para a rotina do laboratório de genética, fer- ramentas que permitem o diagnóstico em nível molecular. Na linha das doen- ças genéticas, o permanente desen- volvimento de novos protocolos tem permitido a pesquisa de pequenas alterações na seqüência de DNA, como,

por exemplo, na fibrose cística.

Outras aplicações especialmente úteis para a PCR é a clonagem de um determinado fragmento de DNA, que pode ser um gene e o conhecimento do DNA codificante (cDNA) obtido a partir da molécula de RNA, o que permite o estudo da expressão de genes.

Finalmente, a PCR tem um gran-

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Figura 1: Curva de amplificação do PCR em Tempo Real. CT – Cycle Threshold. A amplificação mostra 3 fases distintas (1) linha basal: não houve produtos da PCR suficiente para detectar a fluorescência; (2) fase log: a quantidade de produtos da PCR dobra a cada ciclo e (3) fase platô: não há mais aumento no número de produtos.

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813.html, 2004).

Fluoróforos

Os fluoróforos são moléculas que absorvem e emitem luz em um com- primento de onda específico. Os siste- mas de detecção da PCR em Tempo Real utilizam estas moléculas que pro- porcionam o acompanhamento da re- ação ao longo dos ciclos.

SYBR® Green

O SYBR® Green se liga entre a fita dupla de DNA (Figura 2) e com a excitação da luz emitida pelo sistema ótico do termociclador, emite uma fluorescência verde. As vantagens da utilização do SYBR® Green são: baixo custo, facilidade no uso e sensibilida- de. A desvantagem é a ligação em todo DNA fita dupla que surge durante

de potencial na medicina forense. Sua sensibilidade torna possível utilizar uma amostra bastante pequena (traços mí- nimos de sangue e tecidos que pode- riam conter os restos de somente uma única célula) e ainda se obter uma “impressão digital de DNA” da pessoa da qual a amostra foi coletada, poden- do assim fazer comparações com aque- les obtidos de vítimas e/ou suspeitos de casos de infração penal (SILVA & PASSOS, 2002).

O genoma de cada ser humano (exceto dos gêmeos idênticos) é dife- rente nas regiões polimórficas, sendo possível amplificar essas regiões. As- sim, a pesquisa de STRs (Small Tan- dem Repeats) através da PCR, utilizan- do um conjunto de iniciadores que cobrem estas partes altamente variá- veis do genoma humano, pode gerar uma impressão digital característica de DNA para cada indivíduo (BRUCE, 1999).

PCR em Tempo Real

A possibilidade de monitorar a PCR em tempo real revolucionou o processo de quantificação de frag- mentos de DNA e RNA. A PCR em tempo real realiza a quantificação des- tes ácidos nucléicos de maneira preci- sa e com maior reprodutibilidade, por- que determina valores durante a fase exponencial da reação. O ponto que

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detecta o ciclo na qual a reação atinge o limiar da fase exponencial é denomi- nado de Cycle Threshold (CT) (Figura 1). Este ponto permite a quantificação exata e reprodutível baseado na fluorescência.