Relatório de Aula Prática - Enzimas

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Relatório da aula prática - Atividade da peroxidase

Prof. Dra. Giuseppina Pace Pereira Lima

Beatriz Zerbinato Balista

Botucatu, 2020.

Introdução

A peroxidase é uma enzima que degrada Peróxido de Hidrogênio (H2O2). Essa molécula de H2O2 é um radical livre, que pode ser danoso para a célula se presente em grande quantidade, pois causa o rompimento da membrana e a perda de seletividade celular, e como consequência leva a morte celular.

Sendo assim, há o aumento da atividade da enzima Peroxidase para evitar os altos níveis de Peróxido de Hidrogênio e consequentemente a morte celular. A atividade da peroxidase na maioria dos casos, aumenta sob diferentes situações de estresse, provocadas por ferimentos, infecções causadas por fungos, salinidade, déficit hídrico, déficit nutricional, dentre outros, isso ocorre devido à essas condições aumentarem os níveis de peroxido de hidrogênio e assim ocorre o aumento da atividade da peroxidase, para conter os danos à célula. Para que isso seja feito, ela quebra o peroxido de hidrogênio em substancias não danosas.

Além de indicar condições de estresse a peroxidase também indica a qualidade em alimentos – enzimas de escurecimento enzimático; variações de cor, aroma e textura-.  Além de indicar senescência – útil nos pós colheita da indústria do papel.

Nesta aula pudemos aprender sobre a atividade da peroxidase, na batata-doce (‎I. batatas). Foi realizado um procedimento para a extração da enzima.

Material e métodos

Reagentes e Soluções

1. Solução extratora: Tampão fosfato de potássio a 0,2M – pH 6,7

2. Solução A: Peróxido de hidrogênio (H2O2) à 30%

3. Solução B: Fenol e Amino antipirina (AAP)

Ensaio

A amostra foi macerada em nitrogênio liquido

Na balança analítica, foram pesados 500mg de amostra e com auxílio da pipeta automática, foram adicionados 5ml da solução tampão de fosfato de potássio 0,2M pH 6,7. Centrifugaram sob refrigeração por 10 minutos, sob 6000 rpm.

Durante o tempo que a amostra estava na centrifuga foram pré-identificados tubos de ensaio: Branco da solução; Branco da Amostra; Amostra (amostra crua e amostra cozida).

Após ser retirada da centrifuga, foram colocados em cada tubo de ensaio uma quantidade do sobrenadante da amostra. E logo após, os tubos foram colocados em banho maria, pré-aquecido, com temperatura igual a 30º C, durante 5 minutos. Essa é a temperatura ideal para que a enzima peroxidase não desnature.

Com os tubos de ensaio em banho maria, foram acrescentados os reagentes e as reações foram homogeneizadas.

Portanto cada tubo de ensaio, ficou composto pela seguinte reação:

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Importante salientar que no Branco da amostra não foram colocadas as soluções A e B, para não ocorrer a reação com as soluções e ser possível visualizar o que acontece com a amostra. No branco da amostra, para substituir as soluções de substrato e solução que dá coloração à amostra, foi colocado 1,0 ml de água destilada.

Os tubos com as reações foram deixados em banho maria durante 5 minutos. Passado o tempo, os tubos foram transferidos para banho maria em água fervente, e foram mantidos sempre sendo homogeneizados.

Após serem retirados do banho maria, foram realizadas as leituras no espectrofotômetro para medir a absorbância das amostras.

Para essa leitura, o aparelho foi ajustado com 505nm. A cubeta utilizada foi a de vidro, como leitura de referência foi usada a amostra do tubo branco da solução. Logo após, as cubetas contendo as amostras foram preparadas e as leituras realizadas.

Resultados

Após análise espectrofotométrica, foram obtidos os seguintes resultados para as amostras.

Amostra	Leitura (nm)	Resultado Leitura Final
Branco da amostra 1	0,130	0,77
Amostra 1	0,900
Branco da amostra 2	0,026	0,262
Amostra 2	0,288

Resultado para amostra 1:

U.A = (0,77 x 2) / (6,58 x 5 x 0,5)

                           0,5

U.A = 0,18 μmol H2O2 decomposto. min-1. g-1 massa fresca.

Resultado para amostra 2:

U.A = (0,262 x 2) / (6,58 x 5 x 0,5)

                           0,5

U.A = 0.063 μmol H2O2 decomposto. min-1. g-1 massa fresca.