A Enzima de Restrição

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

• São endonucleases produzidas por bactérias para se defender de vírus.
• Enzimas presente em bacteriófagos (bactérias acometidas por vírus) capazes de reconhecer e fragmentar o genoma viral, inativando-o.
• Usadas na biologia molecular devido sua habilidade em produzir cortes em sequencias específicas de DNA, produzindo fragmentos de tamanho diferentes, de acordo com a composição genética dos indivíduos, possibilitando a detecção de polimorfismos.
• Reconhecem sítios específicos no genoma e a corta.
• Verificam a molécula de DNA, localizam uma sequência específica de nucleotídeos, produze um corte específico.
• O polimorfismo é o variante, sendo o que a enzima de restrição procura;
• Diferentes bacteriófagos produzem diferentes enzimas que procuram por diferentes variantes e os cortam;
• RFLP= Restriction Lenght Fragment Polymorfin ( Polimorfismo do tamanho de um sítio de restrição).
• OBS: Para exclusão ou confirmação de paternidade é analisado 13 alelos.
• Utilizadas na biologia molecular para Manipular DNA, clonagem e RFLP.

CONCEITOS

• Nomes derivados dos organismos onde foram encontrados
• EcoRI: Eco (E. coli). R (estirpe RY13).  I (primeira enzima de restrição encontrada nessa bactéria).
• As bactérias têm centenas de enzimas de restrição.
• Enzimas de restrição conhecem e ligam-se a sequências de DNA que variam de 4 a 6 nucleotídeos.
• A maioria das sequências das enzimas são Palindrômicas.
• Sequência palindrômica: aquela que é idêntica em ambas as fitas, no sentido 5’ 3’.

[pic 1]

CLASSIFICAÇÃO DAS ENZIMAS DE RESTRIÇÃO QUANTO AO TIPO DE CORTE:

         - Corte cego: cortam apenas ligações fosfodiéster. Usado em PCR         para detectar polimorfos do tipo RFLP (não permite a recombinação da molécula).        

         - Corte coesivo: além de proceder um corte nas ligações fosfodiéster, também cortam entre as pontes de hidrogênio, permitindo a recombinação da molécula (manipulação genética – TDR).

HAE III

• Enzima de restrição que reconhecem os seguintes sítios: (vermelho)

[pic 2]

• No sítio de reconhecimento, promovem um corte cego na molécula de DNA.

[pic 3]

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[pic 5]

CLASSIFICAÇÃO QUANTO A DISTÂNCIA DO CORTE E O SÍTIO DE RECONHECIMENTO:

TIPO I:

• Cortam a molécula a uma distancia de 1000  pb do sitio de reconhecimento.
• Possui atividade de endonuclease e metilase, clivando sequências aleatórias 1000 pb distantes do sítio de reconhecimento.

TIPO II:

• Cortam a molécula no sitio de reconhecimento.
• A maioria possui atividade de endonuclease, clivando DNA na sequência de reconhecimento.

TIPO III:

• Cortam a molécula a 25 pb do sitio de reconhecimento.

• Atividade de endonuclease e metilase, produzindo cortes a 25 pb do sítio de reconhecimento.

• Como as enzimas de restrição de uma bactéria não digerem seu próprio genoma?
• As regiões do genoma bacteriano análogas ao sitio de reconhecimento do bacteriófago encontram-se metiladas, CH3 presentes no local da ligação, não deixando a enzima se ligar.
• Há controle da expressão genica não havendo transcrição, estando condensada.
• Marca o local para não haver transcrição, pois não há lugar para ligação.
• Hipometilado: regiões se encontram na forma d eucromatina;
• Hipermetilada: regiões estão na forma de heterocromatina;

Epigenética:

• Metilação do DNA e controle da expressão gênica
• A metilação do DNA (adição de um radical metil) é uma forma de controle da expressão de genes. De forma que: regiões hipermetiladas encontram-se altamente condensadas, impedindo a ligação de fatores de transcrição às regiões promotoras do DNA, impedindo a expressão de genes.
• Regiões hipometiladas: encontram-se descondesadas permitindo que os fatores de transcrição liguem-se às regiões promotoras, permitindo a expressão de genes.

•   Importância do processo:

•           Controle da expressão genica
•           Gênese de doenças como câncer:[pic 6][pic 7][pic 8]

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Manipulação genética utilizando enzimas de restrição:

Para obtenção de uma molécula de DNA recombinante, utilizando enzimas de restrição:

• Submete-se a um corte com uma enzima que reconheça o sitio do gene de interesse, na célula doadora.
• Utiliza-se a mesma enzima para proceder o corte no vetor (que pode ser um plasmídio bacteriano ou de vírus).
• Mistura-se as moléculas em um mesmo ensaio para promover a ligação das duas por meio do princippio de complementariedade de bases.
• Utiliza-se um método de eletroporação para inserir o vetor em um microrganismo.
• O microrganismo faz replicar e expressar os genes contidos no vetor.

ELETROPORAÇÃO:

• Método de manipulação genética, no qual aplica-se um campo elétrico em um ensaio contendo o genoma de interesse e a célula que será transformada. O campo elétrico promove a abertura de poros na célula, e a internalização do genoma exógeno.

GENES MARCADORES DE → repórter: produzem proteínas fluorescentes[pic 18]

De resistência: → a antibióticos

                           → pesticidas: ao aplicar o antibiótico/ pesticida, somente aqueles que incorporaram o plasmídio sobrevivem.

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