IDENTIFICAÇÃO DE COMPOSTOS EM EXTRATO DE CASCA DE LIMÃO POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA E PROCESSOS DE REVELAÇÃO

1.INTRODUÇÃO

A cromatografia de camada delgada é uma técnica em que a separação dos componentes de uma mistura está fundamentada no fenômeno de adsorção. Esta técnica consiste de uma fase estacionária fixa em uma placa (de vidro ou alumínio) e uma fase móvel, composta por um solvente ou combinação de solventes, chamado eluente. A amostra a ser analisada é aplicada sobre esta fase estacionária, que é um adsorvente. Os adsorventes deve ser um material poroso podendo ser silica, alumina, poliamida entre outros.

Após a aplicação das amostras, a placa deve ser introduzida em uma cuba de vidro contendo o eluente, a altura do solvente na cuba não deve ultrapassar a linha de aplicação da amostra. Uma vez introduzida a placa na cuba, o eluente ascenderá, por fenômeno de capilaridade, até a extremidade superior. Ao ascender, a fase móvel irá arrastar os compostos menos adsorvidos na fase estacionária, separando-os dos compostos mais adsorvidos. Como a maioria dos compostos orgânicos são incolores, é necessário um processo de revelação para que permita identificar as manchas correspondentes aos compostos presentes na amostra. A visualização pode ser feita através de métodos físicos e químicos. Entre os processos de revelação estão: vapor de iodo, soluções de vanilina, permanganato entre outras e UV.

Muitos compostos podem ser visualizados através da luz ultravioleta (254 a 366 nm) por se tornaram fluorescentes quando excitados por essa radiação. Ao separar substâncias conjugadas e sistemas aromáticas por cromatografia de camada delgada e em seguida revelar por UV, esses compostos impedem a emissão de luz, aparecendo como pontos ou faixas escuras na superfície da placa possibilitando assim o cálculo do fator de retenção. A luz UV é um método não destrutivo de revelação. Isto quer dizer que após a revelação, a mesma placa pode ser revelada por outro método caso seja necessário.

Ao introduzir a placa cromatográfica em uma câmara contendo cristais de iodo, o vapor de iodo combina-se com alguns compostos orgânicos resultando em pontos de coloração marrom avermelhado. O vapor de iodo é também um método de revelação não destrutivo. A maioria dos compostos orgânicos podem ser reveladas por este método. Entretanto, alguns compostos, principalmente compostos saturados, não podem ser visualizados utilizando o vapor de iodo (e nem Luz UV), sendo necessário utilizar outros métodos. Uma das maneiras de se revelar compostos saturados é por meio da oxidação do composto orgânico sobre a superfície da placa utilizando oxidantes fortes e elevadas temperaturas. O procedimento consiste em mergulhar a placa em uma solução alcoólica ou solução ácida.

2.Resultados

Inicialmente foi aplicada a amostra, proveniente de uma extração da casca do limão em duas placas comercia de Cromatografia de Camada Delgada (CCD), visando separar qualitativamente os componentes presentes na casca do limão, foram utilizadas duas cubas, tendo uma como fase móvel hexano e a outra diclorometano (DCM).

Em seguida a eluição, essa que durou 5’42” para a corrida com hexano e 5’31” para a com diclorometano, não foi observada nenhuma mancha visível, indicando que as moléculas presentes não eram cromóforas ou seja não emitem luz na região do visível, o que era esperado, visto que quando a amostra foi aplicada na CCD não observou-se nenhuma coloração. Com isso fez-se o uso de outras técnicas físicas e químicas como revelação por luz UV, e complexação com iodo molecular.

O método utilizando luz UV funciona devido às placas de CCD comercias a base de alumínio conterem o adsorvente já misturado com substâncias fluorescentes, uma vez placa contendo estas substâncias absorverá luz na região do ultravioleta (254 nm) e emitirá luz em outra região, esta emissão tem uma coloração esverdeada e brilhante característica. Quando aplica-se à CCD amostras contendo substâncias oxigenadas (alcoóis, aldeídos, cetona e ésteres) e/ou conjugadas e sistemas aromáticos, estes compostos impedirão a emissão de luz, aparecendo como pontos ou faixas escuras na superfície da placa até cessar a radiação.1 Já na exposição das placas a luz UV de longo alcance (365 nm), como essa radiação apresenta maior energia, ela é capaz de excitar algumas moléculas como oxigenados conjugados (alcoóis) a níveis de maior energia, e essas quando retornam para o nível fundamental emitem radiações por vezes na faixa do visível, exibindo assim uma fluorescência. Utilizando uma câmara de luz UV foi possível observar as diferentes manchas originadas na eluição como mostram as figuras 1-4. E para o calculo do fator de retenção dessas manchas aplicou-se a fórmula 1, sendo o ΔSsolvente fixo em 5 cm, e os valores encontrados estão presentes na tabela 1.

Rf(= ΔSmancha(cm))/(ΔSsolvente (cm)) (formula 1)

Figura 1. CCD exposta a luz UV de comprimento curto (254 nm), em fase móvel de hexano.

Figura 2. CCD exposta a luz UV de comprimento longo (365 nm), em fase móvel de hexano.

Figura 3. CCD exposta a luz UV de comprimento curto (254 nm), em fase móvel de DCM.

Figura 4. CCD exposta a luz UV de comprimento longo (365 nm), em fase móvel de DCM.

Tabela 1. Dados da CCD do extrato da casca de limão após revelação por UV.

UV curto UV longo

DCM Hexano DCM Hexano

ΔSmancha (cm) Rf ΔSmancha (cm) Rf ΔSmancha (cm) Rf ΔSmancha (cm) Rf

1,3 0,26 0 0 2,0 0,4 0 0

1,6 0,32 - - 2,4 0,48 - -

2,1 0,42 - - - -

2,55 0,51 - - - -

3,15 0,63 - - - -

Na literatura são registradas algumas das principais moléculas presente na casca do limão, como hidrocarbonetos α-pireno, β-pireno, γ-terpireno, limoneno, β-mirceno e β-felandreno, de caráter mais apolar, e terpenoides oxigenados como a-terpineol, linalol, acetato de linalila, neral, geranial, acetato de nerila e acetato de geranila que apresentam certa polaridade.2 Na corrida cromatográfica utilizando-se hexano como fase móvel (figura 1 e 2) não observou-se via luz UV a eluição de nenhuma mancha, isso por que os grupos que apresentariam certa fluorescência como moléculas oxigenadas e