A Contagem de Microrganismos

CENTRO FEDERAL DE EDUCAÇÃO TECNOLÓGICA DE MINAS GERAIS[pic 1]

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

COORDENAÇÃO DE GRADUAÇÃO

Laboratório de Instrumentação em Microbiologia – Turma

Profª.

Data da prática:

CONTAGEM DE MICRORGANISMOS

Belo Horizonte

1. Introdução

O material nutriente preparado no laboratório para o crescimento de microrganismos é denominado meio de cultura. Algumas bactérias podem crescer normalmente em qualquer meio de cultura, outras necessitam de meios especiais e existem aquelas que não são capazes de crescer em nenhum meio de cultura já desenvolvido. (TORTORA, 2006)

Uma forma de se medir e quantificar o crescimento bacteriano é através da contagem padrão em placas. Essa técnica baseia-se no fato de que, em condições adequadas, uma bactéria viva isolada se dividirá e formará uma colônia visível em uma placa de ágar, (BLACK, 2002).

É necessário realizar a diluição da cultura original antes de se plaquear a cultura em meio sólido. Por meio de diluições seriadas, coleta-se 1 mL de amostra e transfere-se para tubo contendo 9 mL de água estéril, criando-se uma diluição 1:10. Faz-se uma série de 5 tubos de diluições, partindo-se de 1 mL de amostra do tubo anterior. O número de bactérias por mililitro de fluido é reduzido em 9/10 a cada diluição, (BLACK, 2002).

Transfere-se 1mL de cada diluição para uma placsa de Petri, através de dois métodos diferentes; pour plate (inoculação em profundidade) ou método do spread plate (espalhamento em superfície).

As colônias desenvolvem-se tanto na superfície quanto dentro do meio nutriente. Uma desvantagem do pour plate é que as células podem ser danificadas pelo calor do meio. No spread plate este inconveniente não ocorre.

As colônias que se desenvolvem devem ser contadas, realizando-se a medição em triplicata e calculando-se a média dos resultados. O número médio de colônias é multiplicado pelo fator de diluição, para se determinar o número total de organismos por mililitro da cultura original, (BLACK, 2002).

Cada bactéria representa uma unidade formadora de colônias (UFC). Uma ou mais placas deverão apresentar um número pequeno de colônias, o suficiente para que cada uma seja claramente distinta e possa ser contada. Se as diluições forem feitas de maneira correta, o resultado serão placas com um número contável de colônias (de 30 a 300 por placa), (BLACK, 2002).

1. METODOLOGIA

1. Objetivos:

- Aplicar o método das diluições seriadas e expressar a concentração de microrganismos em UFC/mL;

- Conhecer diferentes técnicas de contagem em placas.

1. Materiais e Equipamentos

- Alças de Drigalsky, pipetadores e ponteiras estéreis, placas de Petri, série de tubos de ensaio, grade para tubos de ensaio, palito de fósforo, erlenmeyer, bico de Bunsen, Autoclave vertical, Estufa Incubadora.

1. Reagentes

- Amostra de terra de jardim (bosque do Cefet-MG, campus I); Meio de cultura (Ágar nutriente), previamente preparado e distribuído em placas; Água peptonada; Água destilada.

1. EPI’s

- Jaleco de algodão com mangas compridas, óculos de segurança, calça comprida e calçados fechados.

1. Procedimento

1. Diluição

Diluiu-se 10g de amostra de terra de jardim em, 90 mL de água destilada, contida em um erlenmeyer. Homogeneizou-se a solução e realizaram-se diluições sucessivas, nas quais 1mL de cada diluição é adicionada a 9 mL de solução salina, em sequência, conforme exemplifica a Figura 1.

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Fig. 1- Diluição seriada (Corbi, K. P., Crescimento Microbiano)

1. Inoculação em Superfície

No método de espalhamento em superfície o inóculo, geralmente de 0,1 a 1,0mL, é espalhado uniformemente na superfície do meio já solidificado, com o auxílio da alça de Drigalsky, de modo a separar ao máximo as células microbianas presentes, conforme Figura 2. Neste caso só crescerão colônias na superfície do meio sólido.

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Fig. 2- Método de Inoculação em superfície (Brock Biology of Microorganisms, 2006 – Google Imagens)

1. Inoculação em Profundidade

No método de espalhamento em profundidade (pour plate) o inóculo, geralmente de 1,0mL, é adicionado ao fundo da placa estéril e o meio de cultura contendo ágar, ainda líquido, mantido a cerca de 40-45 ºC, é vertido sobre ele, conforme Figura 3. A homogeneização do inóculo com o meio é feita através de movimentos rotacionais suaves.É preciso garantir que o meio não solidifique antes da homogeneização nem fique muito quente para não matar as células microbianas. As colônias crescerão não só na superfície, como também no interior do meio de cultura.

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Fig. 3- Método de Inoculação em profundidade (Brock Biology of Microorganisms, 2006 – Google Imagens)

1. Método da filtração

É utilizado para materiais líquidos onde se espera uma pequena quantidade de microrganismos. Neste método, volumes de cerca de 100 mL da amostra são filtrados em uma membrana porosa adequada, que deverá reter os microrganismos. A membrana é colocada na superfície de um meio específico.

1. Resultados e Discussão

Após uma semana do preparo das placas por cada método citado, analisou-se cada placa, contado os microrganismos encontrados nela.Foram feitas duplicatas de duas diluições de cada tipo (pour plate e splash plate) nas concentrações de 10ˉ⁴ e 10 ˉ⁶ da concentração da amostra inicial em solução salina.

       Tabela 1

Método	Diluição	Contagens
Spread Plate	10ˉ⁴	56 e 57 (tapete)
Spread Plate	10 ˉ⁶	30 e 4
Pour Plate	10ˉ⁴	28 e 41(tapete)
Pour Plate	10 ˉ⁶	27 e 7

A tabela 1 mostra os resultados das contagens em cada placa de cada método utilizado.Com isso, é possível fazer a média dos resultados das duplicatas.

          Tabela 2

Método	Diluição	Média da contagem
Spread Plate	10ˉ⁴	56,5
Spread Plate	10 ˉ⁶	7,5
Pour Plate	10ˉ⁴	34,5
Pour Plate	10 ˉ⁶	17

A tabela 2 mostra as médias de cada contagem.Com isso, é possível ter uma melhor estimativa, além de ser possível observar possíveis erros cometidos, como visto na grande diferença entre contagens da diluição a 10 ˉ⁶.